文 章 信 息

期刊名称：Grassland Research(草地研究)
中文标题：利用分子标记技术测定高羊茅和多年生黑麦草幼苗早期生长阶段中内生菌的存在
第一作者：Kendall Lee（美国佐治亚大学）
通讯作者：Kendall Lee（美国佐治亚大学）

编译者：王晓芳 兰州大学草地农业科技学院 在读博士生

说明：该文仅代表编译者对论文的理解，如需参考和引用相关内容，请查阅原文。

摘 要

研究背景——高羊茅（Festuca arundinacea, Lolium arundinaceum）和多年生黑麦草（Lolium perenne）是重要的冷季型饲草和美化草，与内生菌有互利共生的关系。内生菌可使植物具有抗虫性和抗旱性，但也会产生哺乳动物毒素。不产生哺乳动物毒素的新型内生菌已被用作优良品种进行商业生产。种子公司需要在优良的饲料品种中保持足够水准的新内生菌。内生菌的检测采用免疫化学和分子技术，因为这些技术的快速性和可靠性。在幼苗阶段对于检查种子内内生菌的活力至关重要。
研究方法——本研究旨在确定免疫化学和分子方法检测高羊茅品种BarOptima(e34)、Texoma MaxQII(584)和Jesup MaxQ(542)以及多年生黑麦草品种Reminton(NEA2)的幼苗中存活内生菌的最佳的生长阶段。

研究结果——免疫化学检测在种子萌发后的第14天检测到内生菌，但在一些测试品种中，种子萌发后的第42天才检测到内生菌。分子标记Tef1exon在种子萌发后的第28-42天检测到内生菌的比率要低于免疫化学检测方法。然而，在种子萌发后的第14天，使用标记的DNA不足以检测内生菌。

研究结论——我们得出的结论是，在种子萌发后的第42天，可以最准确地检测到幼苗内内生菌，在这段时间内，幼苗内的内生菌定植充分且稳定。
关键词——内生菌，免疫印迹检测，分子标记，多年生黑麦草，高羊茅前言多年生牧草系统对现代牲畜业生产至关重要。高羊茅（Festuca arundinacea, Lolium arundinaceum）在美国和欧洲广泛种植用于饲草生产，并且在美国的种植面积超过1497万公顷（Rogers & Locke，2013）。高羊茅与一种内生真菌（Epichloë spp.）有共生关系（Young et al.，2014）。内生菌对牧草有许多益处，如生物和非生物的胁迫耐受性。然而，它也可能对哺乳动物具有毒性。不同的抗性和毒性是由内生菌产生的生物碱引起的。大多数Epichloë可以产生四类生物碱：麦角生物碱(ergot alkaloids)、吲哚二萜(indole diterpenes)、降黑麦草碱(lolines)和佩拉敏（peramines），每一类都与宿主的保护有关（Young et al.，2014）。麦角生物碱会导致羊茅中毒，这是一个严重的健康问题，影响以内生菌感染的高羊茅为食物的牲畜，这会导致美国牛肉行业每年损失超过10亿美元（Browning，2003）。
多年生黑麦草（Lolium perenne）是另一种在日本、英国、新西兰和澳大利亚广泛使用的冷季饲草（Jung et al., 1996）。多年生黑麦草通常与内生菌Epichloë festucae var. lolii相关。多年生黑麦草内生菌的生物碱组成与高羊茅内生菌相似。多年生黑麦草因含有毒性化合物lolitrem B而引起绵羊的神经性疾病，称为“黑麦草痉挛症(ryegrass staggers)”。Lolitrem B是一种吲哚二萜生物碱，在内生菌感染的高羊茅中没有发现（Philippe，2016）。
通过筛选缺乏麦角生物碱的高羊茅内生菌和缺乏溶糖生物碱但仍具有驱虫作用的黑麦草内生菌，然后将这些被选择的内生菌菌株插入到与内生菌共生的优良牧草品种中，开发出用于夏季更温暖、更干燥地区的商业黑麦草和高羊茅品种。这些无毒的草地内生菌通常被称为“新种(novel.)”。这项研究使用的优良品种——新型内生菌菌株组合包括Jesup MaxQ（内生菌菌株AR542）、BarOptima（内生菌菌株e34）和Texoma（内生菌菌株AR584）高羊茅，以及Remington（内生菌菌株NEA2）多年生黑麦草（Bluett et al.，2005；Bouton，2009）。
种子公司生产的新型内生菌产品在Alliance for Grassland Renewal（https://grasslandrenewal.org）内建立了质量控制标准。Alliance for Grassland Renewal的最低标准是在商业种子批次中提供有毒类型不超过5%和内生菌存活率不少于70%（Pirelli et al., 2016）。在收获季（美国俄勒冈州的7月中下旬）和秋季种子销售（9月初）之间的时间间隔，对于种子批次的清洁和内生菌活力的测定是一项挑战。通常，测定内生菌活力需要测试6周的幼苗植物是否存在内生菌（Missaoui & Hill, 2015）。因此，需要一种快速准确评估幼苗内生菌生存能力的方法以最大限度地缩短检测时间。
确定植物内生菌存在的方法包括显微镜检查、免疫印迹组织打印测试和聚合酶链式反应（PCR）检测内生菌衍生的分子标记（Ahmad et al., 2019）以及基于平板的酶联免疫吸附测定法。高效液相色谱法可用于鉴定生物碱含量（Hiatt et al., 1999）。国际种子检验协会(The International Seed Testing Association)已经批准了显微镜和免疫印迹方法用于内生菌检测（Hill et al., 2002）。首选方法是免疫印迹组织程序，因为这种方法可以同时测试多个样本，需要的培训较少，并且更快速和可靠（Trento et al., 2007）。
通过靶向测序开发了针对内生菌中不同基因的分子标记。这些标记可以用于鉴定内生菌的生物碱特征以及内生菌的存在。目前已经鉴定出了麦角生物碱、降黑麦草碱和吲哚二萜的基因簇。Tef1exon是基因转录延伸因子1-α(tefA)的基因标记，具有将氨基酰转移RNA运送到核糖体的功能。它常用于真菌的鉴定，也是禾本科植物内生菌检测的良好存在/缺失标记（Song & Nan, 2015; Wang et al., 2022）。
本研究的目标是确定在种子萌发后14天、28天和42天（DAG）中的最佳时间点，利用分子和免疫印迹检测方法在高羊茅和多年生黑麦草苗中检测到新型内生菌。

材料和方法

植物取样
在实验室中，使用萌发袋(Mega International)种植了Jesup E-、Jesup MaxQ (542)、BarOptima Plus (e34)和Texoma MaxQII (584)四个高羊茅商业栽培品种以及Albion和Remington (NEA2)两个多年生黑麦草品种。Albion和Jesup E-是不含内生菌的对照组。所有种子均从商业零售商购买。每个时间点（种子发芽的第14天、28天和42天）分别进行三次重复采样，每次采样采集50颗幼苗，总共使用了108个萌发袋。将14天幼苗的假茎基部取约1厘米的部分纵向切开，其中一半用于免疫印迹检测，另一半用于分子标记检测。从28天和42天幼苗采集了两个3毫米长的假茎横截面，并随机分配到免疫斑点或分子标记分析中。分配给免疫印迹分析的样品立即进行内生菌检测。而分配给分子检测的样品则冷冻干燥并存放在-80°C的冷冻箱中，以便日后进行DNA提取和PCR分析。

内生菌免疫印迹检测
用于内生菌检测的所有材料均来自用于检测幼苗分蘖内生菌的商业试剂盒（Cat# ENDO797‐2; Agrinostics Ltd., Co.）（图1b）。在硝酸纤维素膜上轻轻碾压从14天幼苗中切取的假茎片段，以表达组织中的植物汁液。从28天和42天幼苗的假茎横截面的切口处一端向下，将其放置在浸满提取缓冲液的硝酸纤维膜上。所有样品均按照试剂盒中的技术使用说明书进行测试。

内生菌标记检测

将单个的冻干假茎在2010 GenoGrinder (Spex Sample Prep)研磨，并使用Doyle和Doyle（1987）改进的2%十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）方法提取DNA。将DNA稀释至5000 ng µL-1，并使用tef1exon的引物对内生菌进行检测（表1）。PCR的试剂总体积为20 µL：2 µL Taq标准反应缓冲液，1.2 µL MgCl2，0.4 µL脱氧核苷酸三磷酸盐（dNTPs），0.5 µL反向引物（10 mM），0.5 µL正向引物（10 mM），0.08 µL Taq聚合酶，14.32 µL水和1 µL DNA。终点PCR在Bio-Rad C1000热循环仪中进行，按照以下顺序进行：95°C保持15分钟，65°C保持30秒（每个循环降温1°C），72°C保持2分钟，65°C保持30秒（九个循环，每个循环降温1°C），95°C保持30秒，55°C保持30秒，72°C保持2分钟，55°C保持30秒（共24个循环），最后72°C保持7分钟。使用tefA的引物序列为：正向引物Tef1‐exon1d‐1 GGGTAAGGACGAAAAGACTCA和反向引物Tef1‐exon 6u‐1 CGGCAGCGATAATCAGGATAG。每次PCR测试中都使用已知的高羊茅E - DNA作为阴性对照。每个电泳所处理的凝胶上都加入了1 - kb的DNA标准品。结果在2% EtBr琼脂糖琼脂糖凝胶上以100 V和400 W的电流进行45分钟的电泳，并使用Gel Doc EZ Image紫外线光读取器（Bio-Rad）进行可视化（图1a）。 数 据 分 析 使用检测方法（标记或免疫印迹），时间点、栽培品种和草种分析检测到的内生菌百分比。数据中的所有0都改为1.1。然后，对所有数据进行对数转换以进行分析。在RStudio（v. 2022.120+353）中使用R包stats版本4.2.2进行了三因素方差分析（ANOVA）来分析免疫印迹检测和标记检测的结果（RStudio, 2022）。重复被视为随机效应，栽培品种、检测方法和时间点被视为固定效应。然后，通过ANOVA解析了双因素交互作用，并使用R包agricolae版本1.3-5进行最小显著差异（比较两个均值）和邓肯边际排名检验（分离超过两个均值）分离均值。通过计算变异系数（CV）来计算每个品种在每个检测方法和时间段内的分析精度。 结果 方差分析（ANOVA）显示，检测方法、品种和时间对内生菌检出率均有显著影响（p < 0.001；表S1）。品种与检测方法、时间与检测方法以及品种与时间之间也存在显著的双向交互作用（p < 0.001）。针对每个品种和每个时间点进行了方差分析。在所有E+品种中，使用两种检测方法检测到含内生菌的种子的百分比存在差异（p < 0.01）。两种检测方法在所有时间点检测到的E+幼苗的百分比也存在差异（p < 0.001）。DAG是每个E+品种中内生菌存活率存在差异显著的处理因素（除Remington，p < 0.05，其余p > 0.001）。同样，在种子萌发的第14、28和42天，不同品种的内生菌存活率存在显著差异（p < 0.001）。只考虑E+品种时，时间点和检测方法之间存在显著的交互作用。免疫印迹检测方法在所有时间点检测到的内生菌的比例都不明显，但在数量上高于标记测试方法，而在种子萌发的第14和42天时显著高于标记测试方法（p < 0.05）（表S1）。种子萌发的第14天幼苗植株中DNA不足导致PCR方法无法检测到内生菌。尽管内生菌在后期时间点可检测到，但免疫印迹测试继续检测到更高比例的内生菌。免疫印迹测试也证明比标记物测试在时间点上更具一致性（表1）。然而，总体而言，随着从发芽开始的时间增加，不论是品种还是检测方法，内生菌检测的一致性都有所增加。免疫印迹方法在Texoma 584、Jesup 542和Remington等品种中检测到的内生菌比例显著更高（p < 0.05）。对于BarOptima品种，两种检查方法均具有可比性。E-品种Albion和Jesup E-的两种测试方法也具有可比性。每个时间点上检测到的内生菌比例最高的品种各不相同，但Jesup 542和Texoma 584的变异系数一直比较高（图2）。Jesup 542和Texoma 584的变异系数最低，显示了被检测到的内生菌感染率的一致性（表2）。对于Texoma 584、BarOptima和Remington来说，种子萌发的42天的内生菌检出率较第14天或28天时更高（分别为86.13%、76.3%和52.6%）（图2）。 讨 论 本研究的目标是确定在发芽后的哪个阶段可以使用分子和免疫印迹检测方法检测到高羊茅和多年生黑麦草品种中新的内生菌，希望能缩短确定新内生菌感染种子内生菌活力所需的时间。选择Tef1exon作为标记物，因为它是一种被广泛使用和测试的标记物，用于Epichloe sp.的系统发育工作和鉴定，并在文献中被广泛应用（Charlton et al.，2014；Song & Nan，2015；Takach & Young，2014）。结果显示，幼苗的内生菌的共生不同步，不同个体之间存在差异。一些幼苗在14天内被相应的内生菌定值。然而，在42天的生长周期内，种苗共生过程持续进行，随着年龄增长，种苗植株中的内生菌频率增加（图2）。如果能利用早期幼苗的数据来预测42天内生菌感染频率，从而人为地缩短测试内生菌活力所需的时间，将会很有用。然而，基于幼苗的感染频率来准确预测内生菌感染是困难的，因为在同一品种甚至在同一品种的不同时间点之间检测到的内生菌的感染存在差异；内生菌共生在植物之间甚至在同一植株的分蘖之间也有差异。例如，BarOptima的种苗感染率在种子萌发第14天最低，而在第42天时的感染率与Jesup相似。相反，Remington的内生菌感染率在种子萌发第14天时高于BarOptima，但在第42天时却低于BarOptima。同一栽培品种在同一时间点上的变异表明植物间内生菌定殖存在差异。因此，使用生长早期的内生菌感染频率来广泛建模或预测种子萌发42天时内生菌感染频率似乎还不可行。要建立这样的预测模型，还需要进一步基于品种和纳入更多时间点的工作。分子分析的敏感性和准确性表明与基于抗体的免疫印迹系统相比，使用tef1外显子结合PCR技术可以更好地检测内生菌。然而，本研究的数据表明，在种子萌发14天的幼苗植物中，DNA含量不足以检测内生菌。此外，使用tef1标记检测种子萌发第28天和42天的幼苗中内生菌的频率低于使用免疫印迹检测方法（表1）。所有具有新内生菌的培育种类的免疫印迹检测中符合70%内生菌感染的既定标准，但Jesup和Remington在使用分子方法评估42天龄的幼苗时，未达到70%的感染率。此外，通过CV值指示，免疫印迹测定在确定幼苗植物的内生菌感染方面具有更高的精确性。这些发现表明，免疫印迹检测提供比分子分析更准确和精确的数据。不论何种内生菌检测方法，幼苗内生菌出现的频率随着幼苗株龄的增加而增加。这表明这两种系统都无法克服内生菌在幼苗植物中定殖过程的生物学特性。了解内生菌定殖过程可能会导致通过调节环境因素或使用生长调节剂来同步该过程的方法。此外，进一步研究基因层面上的内生菌-寄主相互作用机制可能提供有用的工具。目前，这些处理方法还只是推测，因为对这些相互作用仍有很多未知。但是，通过研究了解定殖过程可能会导致同步或增强真菌定殖过程的技术。这样的研究是为了探究植物和真菌相互作用促进真菌定殖的方式。然而，还需要进一步的工作才能使这些研究结果具有应用性（Barker & Tagu，2000；Hedden & Phillips，2000）。使用商业试剂盒进行免疫印迹检测非常方便易用，不需要大量训练。整个培训需时2天。一套典型的免疫印迹试剂盒约售价100美元可供100个样品使用，每个样品的成本低至约1美元（https://www.agrinostics.com/shop/）。使用分子标记的起始成本较高，但在实验室运作中是可承受的。对植物和真菌组织进行DNA提取可以使用多种不同的方法，这可能会改变成本。当按照我们的标准2% CTAB DNA提取协议计算时，500次提取的成本约为710美元。每次提取的成本仅为1.42美元。PCR试剂的成本约为150美元，可供500次反应使用；引物对的成本为40美元；dNTPs的成本为40美元，可供500次反应使用。因此，PCR每次反应的成本低于50美分。总体而言，使用分子标记进行内生菌检测的成本可以低于2美元，具体取决于所采用的方案和试剂。标记物还可以更有效地收集特定信息。引物可用于针对特定的内生菌基因以确定生物碱含量。可以将多个标记物一起多重复合使用以快速实现这一点。DNA提取和PCR需要经过训练有素的人员进行测试。需时2-3天，包括冷冻干燥、DNA提取和PCR。高羊茅内生菌的最佳检测方法是生产者根据自己的目标决定的。标记和免疫印迹测试都是非常可靠的检测方法，但是各有利弊。

结 论

结果表明在幼苗早期对内生菌的检测并不取决于所使用的检测方法，而是取决于内生菌在幼苗中定殖所需的时间。由于感染程度直到28天后才完全显现，并且不同品种的内生菌定殖时间不同，所以我们建议种子生产商在选择测定方法时候等到种子发芽的第42天进行测试。

图 表

图1：使用内生菌检测的例子。(a) 使用溴化乙锭琼脂糖电泳凝胶显示了Tef1exon标记物的PCR产物。两排凝胶中每一行约有1000个碱基对的条带（由红色箭头标出）表示内生菌的存在。(b) 使用免疫印迹硝酸纤维膜，内部阳性和阴性对照（右上角）以及阴性和阳性幼苗植物对照（分别在顶部标有-和+的行）。PCR代表聚合酶链反应。

图2：在种子萌发后14、28和42天检测到的已测种子的平均内生菌感染百分比。大写字母表示每个时间点在不同品种之间的显著性。小写字母表示每个品种在不同时间点之间的显著性。线条形状和颜色根据草地品种而异。

表1：种子萌发后14、28和42天，IB和内生菌衍生的“Tef1”分子标记的聚合酶链反应测试(Tef1)的平均内生菌检出率。

注：报告每个时间点和每种检测方法的LSD。平均值后的字母表示使用对数转换数据计算的每种检测方法的显著性水平(列)。缩写：IB，免疫印迹；LSD，差异不显著；Tef1，平移伸长因子1。

表2：各采样期各品种内内生菌检测的变异系数及检测方法。

原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/glr2.12053

DOI：https://doi.org/10.1002/glr2.12053

内容来源：Grassland Research（草地研究）Early View（投稿：2023-02-09；接收：2023-05-23；刊发：2023-07-24）
引用格式：Lee, K., Hill, N., Dela Cerna, C., & Missaoui, A. (2023). Determining the earliest growth stage to detect the presence of endophytes in tall fescue and perennial ryegrass seedlings using molecular markers. Grassland Research, 2(2), 106–111.

排版：徐萌蔚
统筹：王新宇
声明：该编译文章仅代表编译者对原文的理解，如需参考和引用相关内容，请查阅原文。编译文章由GR团队制作仅供学术交流，转载须注明转载自Grassland Research微信公众号及编译作者信息。

期刊介绍

Grassland Research是我国草业科学领域第一本国际学术期刊，季刊，由中国草学会和兰州大学共同主办。该刊受中国科技期刊卓越计划高起点新刊项目支持，由国际出版集团John Wiley & Sons Australia, Ltd.提供出版及宣传服务，于2022年正式出版。

Grassland Research论文刊发范围广，综合性强。从分子到全球变化层面，全维度聚焦草业科学及其在人类可持续发展中的作用。期刊将刊登天然草原，栽培草地、草坪和生物能源作物，以及草地生态系统三大板块的基础性和应用性研究成果、综述、论点等类型的文章。优先考虑发表青年学者优秀研究成果，期待成为青年科学家喜爱的国际学术交流主阵地。

在创刊前三年，Grassland Research将免收版面费，以OA形式通过全球化出版平台Wiley Online Library出版。