源于细菌古老免疫系统的CRISPR/Cas9复合体以RNA为向导 (gRNA) 对DNA的特定位置进行剪切，并在无模板修复过程中引入基因突变，这一现象的发现为基因编辑的实现开启了技术大门。自2013年在模式植物拟南芥和本生烟草中成功实现基因编辑，CRISPR/Cas9技术已成为高效、精准改良粮食作物的重要分子手段，其在禾本科及豆科牧草品质改良方面的研究也日渐成为焦点。因此在这篇综述文章中，王增裕教授团队对目前CRISPR/Cas9技术在多种牧草中研究的进展进行了总结，并讨论了其未来发展的挑战和前景。

“牧草皇后”紫花苜蓿 (Medicago sativa L.) 是全球最重要的牧草作物之一。文章归纳了CRISPR/Cas9技术在紫花苜蓿基因改良上已报道的相关应用，并结合课题组对持绿性相关基因MsSGR的基因编辑实验，针对紫花苜蓿基因编辑效率低的问题，比较了单gRNA和多gRNA，AtUBQ和CaMV35S启动子对编辑效率的影响。结果表明AtUBQ启动子及多gRNA有利于提高紫花紫花苜蓿的编辑效率。此外，文章对CRISPR/Cas9技术在豆科牧草蒺藜苜蓿(M. truncatula)、百脉根(Lotus japonicus)，禾本科牧草柳枝稷(Panicum virgatum)、黑麦草(Lolium perenne)、狗尾草(Setaria viridis)中的应用及品质改良进行了总结。

文末，作者提出未来CRISPR/Cas9技术在牧草品种改良及创制中更广泛应用，依赖于gRNA设计、Cas9启动子等基因编辑体系的进一步优化，更多稳定高效的遗传转化体系在牧草物种中的建立，以及相关法规政策的调整。文章深化了高效、精准的牧草培育的理论基础和思考方向。

Figure 1. Schematic diagram of the multiplex genome editing vectors. (a) Map of the multiplex vector version I in which Cas9 is driven by the CaMV35S promoter. (b) Map of the multiplex vector version II in which the gRNA scaffold is modified; the 5′ of gRNAs of vector Ⅱ consist of a point mutation at TTTTT to TTGTT to abolish the pausing effect of continuous Ts. (c) Map of the multiplex vector version Ⅲ in which Cas9 is driven by the AtUBQ10 promoter.

Figure 2. Mutagenesis efficiency and phenotype of alfalfa Stay-green (MsSGR) mutants. (a) Mutagenesis efficiency of single and multiplex gRNA-CRISPR/Cas9 vectors (versions Ⅰ, Ⅱ, and Ⅲ) in MsSGR gene editing. (b) Phenotype of the alfalfa MsSGR knockout mutant (CRISPR) and knockdown (RNAi) lines induced by dark treatment. The CRISPR/Cas9 generated mutants (MsSGR-18, MsSGR-21, MsSGR-36, and MsSGR-53) included in this dark treatment assay showed a strong stay-green phenotype. MsSGR-RNAi transgenic lines showed light green leaves after 10 days of dark treatment. Null#02 and Null#11 are empty vector controls for the RNAi lines. CRISPR/Cas9, clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9; RNAi, RNA interference.

Figure 3. Chlorophyll content (chlorophyll a + b) in detached leaves of alfalfa MsSGR mutants at different timepoints (0, 5, 10 days) of dark treatment. The blue bar graph shows the total chlorophyll content at fresh leaf harvesting time (zero days dark treatment), the red bar shows the total chlorophyll content on the 5th day of dark treatment, and the green bar shows the total chlorophyll content on the tenth day of dark treatment. EV2, empty vector control; MsSGR, alfalfa stay-green.Table 1. Genome editing by CRISPR/Cas9 in forages

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原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/glr2.12036

内容来源：Grassland Research（草地研究）Early View（投稿：2022-12-7；接收：2022-12-12；刊发：2023-01-02）

DOI： https://doi.org/10.1002/glr2.12036

引用格式：Bao, Q., Wolabu, T. W.,Zhang, Q., Zhang, T., Liu, Z., Sun, J., & Wang,Z.‐Y. (2022). Application of CRISPR/Cas9 technology in forages. Grassland Research, 1(4),244–251.

文章信息编译者：雷蕾 兰州大学草地农业科技学院 教授

说明：该文仅代表编译者对论文的理解，如需参考和引用相关内容，请查阅原文。

期刊介绍

Grassland Research是我国草业科学领域第一本国际学术期刊，季刊，由中国草学会和兰州大学共同主办。该刊受中国科技期刊卓越计划高起点新刊项目支持，由国际出版集团John Wiley & Sons Australia, Ltd.提供出版及宣传服务，于2022年正式出版。

Grassland Research论文刊发范围广，综合性强。从分子到全球变化层面，全维度聚焦草业科学及其在人类可持续发展中的作用。期刊将刊登天然草原，栽培草地、草坪和生物能源作物，以及草地生态系统三大板块的基础性和应用性研究成果、综述、论点等类型的文章。优先考虑发表青年学者优秀研究成果，期待成为青年科学家喜爱的国际学术交流主阵地。

在创刊前三年，Grassland Research将免收版面费，以OA形式通过全球化出版平台Wiley Online Library出版。

排版 | 王楚怡

执行编辑 | 王楚怡

审核 | 彭京伦 武艳培 王新宇