近日，《表型组学》（Phenomics）在线发表了复旦大学生命科学学院洪尚宇研究员团队题为“Living Conditions Alter Ketogenic Diet-induced Metabolic Consequences in Mice through Modulating Gut Microbiota”的研究论文。

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https://link.springer.com/article/10.1007/s43657-024-00161-1

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动物实验为生物医学研究提供了疾病发生发展过程和潜在治疗方法有效的研究工具。再现性和可靠性是动物实验的关键，它们受到多种因素的影响，包括动物的基因背景、环境因素、实验过程和分析方法等。而相比于其他因素，环境因素如饲养条件、饮食和水质等，对实验结果尤其是代谢实验结果有着重大影响。然而，环境因素在动物实验中往往被忽视。在过去的研究中，研究人员常观察到在无特定病原体（SPF）环境与传统环境中饲养的动物表现出不同的表型。SPF条件下饲养的动物没有特定病原体，通常导致代谢特征的变异性较小，如体重增加、血糖水平及其他代谢参数。相反，在传统环境中的动物暴露于更广泛的病原体和微生物，导致更大的代谢变异性。除此之外，饲养环境的物理条件，包括温度、湿度、光照周期、空间和饮水等因素，也会对动物的生理和行为反应产生深远影响。

生酮饮食（KD）是一种特殊营养结构（高脂低糖适量蛋白质）的配方饮食，常被用于减肥、治疗顽固性癫痫和糖代谢缺陷疾病（如葡萄糖转运体I缺陷症、丙酮酸脱氢酶缺乏症）。正常饮食情况下，食物中超过50%的热量来源于碳水化合物，约35%的热量来源于脂肪，生物机体也主要以葡萄糖作为直接能量来源。而经典的KD，超过90%的热量来源于脂肪，碳水化合物来源的热量占比少于2%，因此迫使生物机体利用脂肪和脂肪代谢产生的酮体为身体提供所需的能量。来自人群和模式动物的研究都表明，KD会引起一系列代谢相关的生理改变，如体重减轻、血糖降低和胰岛素敏感度增强，但也有报道指出长期使用KD会引起血脂升高等问题。

洪尚宇研究员团队长期研究生酮饮食对能量平衡和糖脂代谢的影响及其分子机制，相关研究成功发表在Nature Metabolism，Journal of Hepatology以及Advanced Science等杂志上。在研究过程中，他们发现，在传统环境中饲养的小鼠在接受生酮饮食时，其体重的减轻幅度比在SPF环境中饲养的小鼠更为显著（图1）。具体而言，在传统环境中，生酮饮食导致体重减少了32.3%，而在SPF环境中则只减少了15.4%。在空腹血糖水平方面，生酮饮食在两种饲养条件下都导致了其显著的下降，但在传统环境中饲养的小鼠下降幅度更大（50.8%），而SPF饲养的小鼠则为34.8%。最后，生酮饮食导致传统环境中饲养的小鼠血清总胆固醇水平显著升高（增加了196.4%），而在SPF环境中饲养的小鼠则仅为26.4%的增幅。

图1、在小鼠实验中，生酮饮食的代谢表型受饲养环境的影响

洪尚宇研究员团队还注意到研究中小鼠饮用水的pH值对生酮饮食诱导的代谢变化也有较大影响。在动物实验中使用酸化水主要是为了控制和减少动物饮用水中的微生物负荷，尤其是病原体的生长。这种方法通过降低水的pH值（通常在2.5到3.0之间）来创造一个不利于大多数细菌和真菌生存的环境，从而减少这些微生物对实验动物健康的潜在影响。尽管酸化水有这些优点，但也可能会影响动物的代谢反应。因此，仍然有相当一部分的实验动物研究机构并不使用酸化水。洪尚宇研究员团队给SPF饲养条件下生酮饮食的小鼠提供了酸化水（pH 2.5-3.0）或非酸化水（pH 8.0-8.5），并比较了二者对生酮饮食小鼠的影响，结果发现饮用水的pH值对生酮饮食的代谢表型有显著影响（图2）。具体而言，在喝正常饮用水的小鼠中，生酮饮食导致体重减少了18.7%，而在喝酸化水的小鼠中则只减少了10.2%。另一方面，生酮饮食导致饮用正常水的小鼠血清总胆固醇水平升高24.6%，而饮用酸化水的小鼠则仅为15.5%的增幅。

图2、在小鼠实验中，生酮饮食的代谢表型受饮用水pH值的影响

肠道微生物群正越来越被认为是饮食对代谢健康影响的关键媒介。洪尚宇研究员团队近期发表在Nature Metabolism上的研究表明生酮饮食可以显著改变肠道微生物群的组成和功能。反之，生酮饮食相关的肠道微生物群变化可以通过多种机制影响宿主代谢。在该研究中，研究团队对比了饲养条件和饮用水的pH值对肠道微生物群组成的影响，发现不同实验组之间的微生物群落存在显著差异，在同样喂食生酮饮食的情况下，在传统饲养条件下生长的小鼠肠道中Firmicutes, Bacteroidota, Desulfobacterota, Campilobacterota, 以及Deferribacterota 的丰度显著高于在SPF饲养条件下的小鼠，而Actinobacteria的丰度则显著低于SPF饲养条件下的小鼠；此外，SPF饲养条件下的小鼠微生物α多样性显著低于传统饲养条件下生酮饮食的小鼠。同样的，与饮用正常水的小鼠相比，饮用酸化水会引起小鼠肠道菌群丰度的显著变化。

该研究证实环境因素，特别是饲养条件和饮用水pH值显著影响小鼠对生酮饮食的代谢反应。该研究结果强调了通常被忽视的环境因素在动物研究中重要性。该团队呼吁在发表论文中应更标准化和详细地报告实验条件，以提高研究结果的可重复性和可靠性。此外，不同环境背景下观察到的饮食引起的代谢反应差异性表明，根据个体的环境和生活方式因素量身定制饮食干预措施，可能会优化饮食干预的结果。

复旦大学生命科学学院洪尚宇研究员和上海体育大学田海丽副教授为共同通讯作者，复旦大学生命科学学院杨洁硕士和李潇博士为共同第一作者。该项目获得国家自然科学基金面上项目、科技部重大专项、上海市科委面上项目和国家重点实验室开放课题基金资助。

Many laboratories have demonstrated that the ketogenic diet (KD) can lead to weight loss and reduced fasting glucose levels, while also increasing total serum cholesterol levels. However, it's worth noting that the specific outcomes induced by KD can vary across different research settings. Certain studies have indicated that environmental factors, such as housing conditions and the acidity of drinking water, can influence physiological parameters and gut microbes in mice. Thus, our current study aimed to investigate whether differences in housing conditions and pH levels of drinking water contribute to variations in KD-induced phenotypes and gut microbes. Our findings revealed that mice housed in conventional (CV) conditions experienced more significant weight loss, lower fasting blood glucose levels, and a greater elevation of blood cholesterol levels compared to those in the specific pathogen-free (SPF) condition. Additionally, similar differences were observed when comparing mice fed with non-acidified water versus acidified water. Furthermore, we analyzed cecum content samples using 16S rRNA sequencing to assess gut microbial composition and found that the tested environmental variables also had an impact on the gut microbial composition of KD-fed mice, which was correlated with their phenotypic alterations. In summary, both housing conditions and the pH of drinking water were identified as crucial environmental factors that influenced KD-induced changes in metabolic phenotypes and gut microbes. Our study emphasizes the importance of considering these factors in animal studies related to KD and gut microbes, as well as in other types of animal research.