近日，《表型组学（英文）》（Phenomics）在线发表了重庆医科大学特聘教授吴家雪和复旦大学生命科学学院副教授徐颖题为 “Identification of Poly(ADP-ribose) Polymerase 9 (PARP9) as a Potent Suppressor for Mycobacterium tuberculosis Infection”的研究论文。

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Zhu, Z., Weng, S., Zheng, F. et al. Identification of Poly(ADP-ribose) Polymerase 9 (PARP9) as a Potent Suppressor for Mycobacterium tuberculosis Infection. Phenomics (2023). https://doi.org/10.1007/s43657-023-00112-2

研究背景

ADP-核糖基化 (ADP ribosylation, ADPr) 是由ADP-核糖基转移酶 (ADP-ribosyltransferases, ARTs) 介导的一种可逆、动态的翻译后修饰。聚-ADP核糖聚合酶 (poly ADP-ribose polymerases, PARPs) 是人类ARTs的一个重要家族，广泛调节多项细胞生命活动的生理进程，如DNA损伤修复、转录调控、胞内转运等；在代谢异常、应激反应、癌症发生发展、炎症反应等病理过程中也发挥重要功能。

研究表明，ADP-核糖基化和PARPs在宿主与病原体的相互作用中起着至关重要的作用，尤其是在病毒感染中。然而，ADP-核糖基化和PARPs在分枝杆菌感染中的功能和潜在分子机制尚不清楚。因此，该研究通过生物信息学分析了结核病患者中PARPs家族的表达变化，并通过感染模型验证了分枝杆菌感染过程中PARPs表达水平的变化，并进一步研究了宿主PARP9在分枝杆菌感染中的生物学功能，更新了对分枝杆菌感染过程中PARP表达变化的理解，并为PARP9作为分枝杆菌感染的有效抑制因子提供了证据。

研究结果

为研究PARPs在分枝杆菌感染中的作用，作者对来自GEO数据库的微阵列数据集GDS4966进行了生物信息学分析。结果表明，结核病 (tuberculosis, TB) 患者的外周血单核细胞(PBMCs) 中PARP9、PARP10、PARP12、PARP13的转录水平显著高于健康人群 (healthy donor, HD)， PARP5a、PARP7的转录水平显著降低（图la）。通过芯片数据集GDS4966分析TB患者在治疗前后的PARPs转录水平，发现TB患者接受抗结核化疗6个月后，PBMCs中的PARP3、PARP5b、PARP9、PARP10和PARP11的转录水平显著降低，PARP7的转录水平显著升高（图1b）。此外，作者在一个包含6363名受访者的队列研究（GSE103147）中筛选得到242个TB患者和498个健康人的全血转录组数据，分析发现与健康人群相比，TB患者的PARP9、PARP10和PARP14的转录水平显著上调，而PARP5a、PARP15和PARP16的转录水平显著下调（图1c）。上述分析结果表明，PARPs在结核病患者中表达失调，其中PARP9和PARP10显著上调，表明PARP9和PARP10可能在分枝杆菌感染中起重要作用。

图1 结核病患者中PARPs的转录水平失调

此外，作者还从微阵列数据集GDS4257分析了PARPs在小鼠感染结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis, Mtb) 前后表达水平的变化情况，发现感染Mtb 21天后的小鼠肺部PARP8、PARP9、PARP10、PARP11、PARP12、PARP13和PARP14的表达水平相较于感染0天显著升高；而PARP7和PARP16的表达水平显著降低。

图2 小鼠感染Mtb后肺部PARPs的转录水平变化

卡介苗(BCG) 和耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis, Ms) 是研究分枝杆菌感染的常用模型菌株。在Mtb感染的早期阶段，巨噬细胞是Mtb滞留和潜伏感染的主要场所；而在感染后期，Mtb通过肺上皮细胞转运到肺部组织。

为进一步验证分枝杆菌感染后PARPs的表达变化，作者检测了BCG感染的THP1诱导分化的巨噬细胞和Ms感染的肺腺癌A549细胞中，在BCG或Ms感染后0、12、24、48h的促炎细胞因子和PARPs的表达情况。结果表明，BCG感染THP1细胞后，PARP6、PARP7、PARP9、PARP10、PARP12、PARP13、PARP14、PARP15的mRNA水平显著升高（图3a）。其中PARP9、PARP10、PARP12和PARP14的mRNA水平在感染后12h内就显著升高，且在感染后48 h的差异倍数达15–32倍，表明这四种PARPs的mRNA水平对BCG感染的响应快且显著。Ms感染A549细胞后，虽然PARP9、PARP10、PARP12和PARP14的mRNA表达在12h和24h时的增加不显著，但在感染后48 h时，mRNA水平显著升高（图3b）。尽管Ms感染的A549细胞系中PARPs在mRNA水平上的差异倍数不如BCG感染巨噬细胞时显著，但两种细胞系中mRNA水平的升高趋势相同。

图3 Mtb模式菌株感染后，PARP9、PARP10、PARP12和PARP14的mRNA水平显著上调

作者还通过体外感染实验和Western blot检测了上述四种PARPs在感染后0、12、24、48h的蛋白表达，并进行灰度值分析。结果表明，BCG感染巨噬细胞（图4a）或Ms感染A549细胞（图4a）后，PARP9、PARP10、PARP12和PARP14的蛋白水平随时间推移而不断升高，与mRNA水平的变化趋势基本一致。此外，统计图显示，在Ms感染A549细胞模型中，这四个PARPs在蛋白水平的响应更加迅速，但在BCG感染巨噬细胞模型中四种PARPs的蛋白相对水平的最终升高更为显著。

这些结果表明PARP9、PARP10、PARP12和PARP14在分枝杆菌感染中mRNA和蛋白水平的表达均显著增加，提示它们可能在这一过程中发挥生物学作用。

图4 Mtb模式菌株感染后，PARP9、PARP10、PARP12和PARP14的蛋白水平显著升高

PARP9已被证实与多种疾病的发生和进展相关，并在病毒感染中发挥作用。上述研究表明，在分枝杆菌感染过程中PARP9和PARP10的表达上调最显著。PARP9在生信分析和体外Mtb感染实验中的表达变化一致，且PARP9在细菌感染中的相关研究较少。因此，作者选择PARP9展开进一步研究。

作者首先成功构建了两个PARP9缺陷的A549细胞株(KO1和KO2)（图5a-c），随后用Ms感染A549细胞株野生型和缺陷型，分析感染后0、6、24、48h的菌落生长情况。结果表明，感染0h时，进入敲除株KO1和KO2胞内的Ms数量显著高于A549野生型（图5d），表明宿主PARP9缺失显著提高Ms的胞内侵染效率。通过相对CFU倍数统计图可知，在感染早期(0–6h)，Ms在敲除株KO1和KO2中的增殖速率和野生型相比无显著差异；感染24h和48h时，Ms在敲除株内的增殖速率显著高于野生型（图5e），表明宿主PARP9缺陷提高了Ms在宿主细胞内的增殖能力。

综上，PARP9缺陷显著提高了Ms的侵染效率和胞内增殖能力。

图5 PARP9缺陷显著提高Ms的感染效率和细胞内增殖能力

为进一步验证上述结果并消除CRISPR-Cas9技术的潜在脱靶效应影响，作者通过慢病毒感染在缺陷株KO2基础上成功构建了PARP9回复表达株(KR1和KR2)，并验证了PARP9的蛋白表达（图6a）。随后，用Ms感染A549野生型、PARP9缺陷型和回复表达株，分析感染后0、6、24、48h的菌落生长情况。结果表明，PARP9回复株KR1和KR2在感染0h的胞内侵染菌数显著低于敲除株，表明PARP9回复表达显著降低了Ms的胞内侵染效率（图6b），拯救了侵染效率表型。根据相对CFU倍数统计图，发现感染48h后，Ms在回复株KR1和KR2中的增殖速率显著低于PARP9缺陷株（图6c），表明PARP9回复表达抑制了Ms的胞内增殖能力。

综上所述，PARP9回复表达有效挽救了PARP9缺陷导致的表型，并显著抑制了Ms的感染效率和胞内增殖能力。

图6 PARP9回复表达抑制Ms的感染效率和细胞内增殖能力

研究结论

综上所述，该研究发现TB患者和感染Mtb小鼠中多个PARPs的转录水平发生显著变化。分枝杆菌感染期间，PARP9、PARP10、PARP12和PARP14的 mRNA和蛋白水平显著升高。进一步研究发现宿主PARP9可抑制Ms的胞内感染和增殖能力，揭示了PARP9作为分枝杆菌感染的有效抑制因子的功能，为TB患者的防治提供了新的思路。

Abstract

ADP-ribosylation is a reversible and dynamic post-translational modification mediated by ADP-ribosyltransferases (ARTs). Poly(ADP-ribose) polymerases (PARPs) are an important family of human ARTs. ADP-ribosylation and PARPs have crucial functions in host-pathogen interaction, especially in viral infections. However, the functions and potential molecular mechanisms of ADP-ribosylation and PARPs in Mycobacterium infection remain unknown. In this study, bioinformatics analysis revealed significantly changed expression levels of several PARPs in tuberculosis patients compared to healthy individuals. Moreover, the expression levels of these PARPs returned to normal following tuberculosis treatment. Then, the changes in the expression levels of PARPs during Mycobacterium infection were validated in Tohoku Hospital Pediatrics-1 (THP1)-induced differentiated macrophages infected with Mycobacterium model strains bacillus Calmette-Guerin (BCG) and in human lung adenocarcinoma A549 cells infected with Mycobacterium smegmatis (Ms), respectively. The mRNA levels of PARP9, PARP10, PARP12, and PARP14 were most significantly increased during infection, with corresponding increases in protein levels, indicating the possible biological functions of these PARPs during Mycobacterium infection. In addition, the biological function of host PARP9 in Mycobacterium infection was further studied. PARP9 deficiency significantly increased the infection efficiency and intracellular proliferation ability of Ms, which was reversed by the reconstruction of PARP9. Collectively, this study updates the understanding of changes in PARP expression in Mycobacterium infection and provides evidence supporting PARP9 as a potent suppressor for Mycobacterium infection.

通讯作者

吴家雪

吴家雪，现任重庆医科大学特聘教授，博士生导师。2006年获复旦大学博士学位。主要研究方向为PARPs在疾病（肿瘤、免疫等）中的功能及机制研究、疾病（肿瘤、免疫等）相关新靶标鉴定与化学干预。承担或参与国家传染病科技重大专项、重点研发计划和自然科学基金等项目，在NatureStructural and MolecularBiology、CurrentBiology、NucleicAcidsRes、Oncogene等期刊发表论文30余篇，获得教育部高等学校科学研究优秀成果奖（科学技术）二等奖。

通讯作者

徐颖

徐颖，现任复旦大学副教授，硕士生导师。2007毕业于复旦大学获得理学博士学位。致力于结核分枝杆菌感染与免疫和新型结核病疫苗的研制；先后主持国家自然科学基金面上项目、“十三五”国家重大专项（任务级）、“十四五”国家重点研发计划（子课题级）、国家自然科学基金青年项目、上海市自然科学基金项目等的研究。研究工作在EMI、Gut Microbes、Redox  Biology、JBC等杂志发表，其中以第一作者或通讯作者发表SCI论文20余篇；获得国内发明专利5项；并获上海市科技进步三等奖。

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