论文DOI链接：https://link.springer.com/article/10.1007/s43657-022-00075-w

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该研究采用大样本人群队列的研究方法，对淋巴瘤（NHL）及淋巴增生性疾病亚型的分子特征进行了探究。研究利用数据非依赖采集（DIA）的质谱方法，对来自临床患者的新鲜冷冻淋巴结样本进行了定量蛋白质组学分析，主要包括26例B型淋巴瘤（B-NHL）、12例T型淋巴瘤（T-NHL）、27例淋巴结炎（Lymphadenitis）、19例肿瘤转移性淋巴结（TLN）与22例非肿瘤淋巴结（TNM:N0），报道了不同淋巴瘤亚型之间差异表达的蛋白谱。

研究背景

淋巴瘤是起源于淋巴造血系统的恶性肿瘤，全世界每年约有56.6万新发病例和30.5万死亡病例，是人类第七大常见癌症。淋巴瘤一般被分为两个主要亚型——霍奇金淋巴瘤（HL）和非霍奇金淋巴瘤（NHL）。在所有淋巴瘤病例中，NHL占比接近90%，可进一步细分为B细胞肿瘤（B-NHL）和T/NK细胞肿瘤（T-NHL）等亚型。

目前，淋巴瘤的临床诊断和预后管理依赖于多种参数，包括组织学、细胞学、免疫分型和临床数据等的结合。并且高度依赖于病理学家的临床经验。近年来，基因组测序的技术进步使淋巴瘤的分子特征分析取得了重要突破。然而，由于对这种高度异质性疾病表型的特异性认知不足，许多基因标志物在区分复杂病例方面的能力十分有限。因此，开发高度特异性的基于蛋白质表达水平的淋巴瘤分子分类器，对患者的精准施治十分重要。

研究结果

该研究应用DIA-MS方法，共检测了109个患者淋巴结样本的蛋白质组，这些样本分别代表了具有不同组织来源和预后潜力的主要淋巴瘤亚型，包括19例实体肿瘤转移淋巴结（TLN）、27例淋巴结炎、22例非肿瘤淋巴结（TNM:N0）、3例HL病例和38例NHL病例，其中包括26例B-NHL病例和12例T-NHL病例。B-NHL队列包含分为侵袭性和非侵袭性B-NHL病例，T-NHL队列包含血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤（T-AITL）、外周T细胞淋巴瘤（T-PTCL NOS）等亚型。如图1所示。

图1 蛋白组学用于表征淋巴增生性疾病

研究人员首先构建了区分NHL、淋巴结炎和非肿瘤淋巴结的分类器。在NHL和非肿瘤淋巴结（TNM:N0）之间差异蛋白的表达图谱中，HSPD1、SULT1A1、ANXA4/6等蛋白在NHL中明显低于TNM: N0组，而Actin的丰度在所有主要的亚组中没有显著差异。研究人员还发现，CD209、CPA3和MCM3/7在非肿瘤淋巴结、淋巴结炎和淋巴瘤的样本中分别呈现逐级递增或递减的趋势。贯穿整个数据集的蛋白拟时序分析显示了TNM:N0和NHL位于发育过程的两端，而淋巴结炎的样品位于TNM:N0和NHL之间的中间（图2）。

图2 淋巴瘤、淋巴结炎和非肿瘤淋巴结相关的蛋白质组学特征

之后，研究人员对ANXA6在NHL和TNM:N0之间的差异在患者淋巴结切片上进行了免疫组化验证。实验结果显示，与TNM:N0组相比，NHL中ANXA6的染色强度明显较低。这和MS的定量结果高度吻合。如图3所示。

图3 ANXA6在NHL与非肿瘤淋巴结之间有明显的表达差异

为了表型NHL亚型相关的分子图谱，研究人员进一步分析了B-NHL和T-NHL的蛋白学数据。结果显示，NAGA、HEXA/B、PLCG2等蛋白在B-NHL中与T-NHL中具有显著不同的分子表达特征。免疫组化的结果与蛋白质组分析结果一致，B-NHL样本中的PLCG2表达量显著高于T-NHL样本。如图4所示。

图4 与NHL亚型相关的特定分子特征

同时，针对B-NHL的侵袭性，研究人员也对潜在的与侵袭性密切相关的分子标志物进行了筛选，结果显示，22个差异分子使得非侵袭组患者样本在主成分分析图上呈现明显聚集。值得注意的是，前10个候选蛋白中有4个是MCM家族蛋白（MCM2/3/4/7）的成员，表明该蛋白家族可能与B-NHL的侵袭性有关。如图5所示。

图5 MCM家族蛋白与B型淋巴瘤的侵袭性密切相关

外周T细胞淋巴瘤（PTCL）是一种特殊的T-NHL，具有较高的异质性，可进一步分为AITL和PTCL-NOS两个亚型。然而，AITL和PTCL-NOS在基因表达谱以及形态学和免疫表型特征上有一些相似之处。因此，在亚型水平上对PTCL进行精确诊断仍然具有挑战性。在该研究中，科研人员比较了AITL和PTCL-NOS的蛋白质组学特征，并发现了一些与亚型特异性相关的分子。值得注意的是，其中许多分子在淋巴瘤中表现出很大的异质性，而它们在其他非淋巴瘤样本中的表达水平却相当相似和稳定。这一类蛋白包括大量的ANXA家族成员，其表达水平在T-AITL样本中是独特的，与其他NHL病例有很大不同（图6）。

图6 复杂淋巴瘤（AITL与PTCL-NOS）的比较研究

最后，研究人员整合了从所有组别分析中获得的所有429个特征蛋白，并使用剖分树（Partitioning Tree）和弹性网络（Elastic Net）方法将它们组合起来，生成了不同临床亚组的代表性层次树，每个分支的每个节点都以对应队列中最具代表性的疾病表型命名。根据蛋白质在各分类中出现的频率，以及它们在样本中的表达模式，优先选择了总共8个蛋白质，代表了分类的关键特征。SYNPO2、TIMM13、TPMT和DDX58等分子在不同亚型之间表现出了明显的表达差异。最后，研究人员总结了这些具有高辨别能力的代表性蛋白质，并提出了临床淋巴疾病分层的逐步分类策略。如图7所示。

图7 淋巴增生性异常疾病的分层分类策略

总结

该研究中选取来自个体患者的淋巴结组织生成了涵盖主要的淋巴增生性疾病类型的定量蛋白质组学数据资源。这种大规模的临床蛋白组分析数据资源，以及筛选出的与疾病相关的特征蛋白可用于多种方式探索淋巴瘤中的蛋白表达及其调控，同时也将扩大现有的淋巴瘤诊断工具，为淋巴瘤的精准医疗实践提供依据。

严威教授课题组简介

严威教授

上海交通大学系统生物医学研究院严威教授课题组主要致力于蛋白质组学质谱分析技术的创新研发及其在生物医学转化上的系统应用，重点运用靶向定量蛋白质组学技术开展疾病相关的蛋白质分子标志物的研发，探索蛋白质质谱分析在临床诊断、预后、伴随性治疗中的转化运用。 

Abstract

An altered proteome in lymph nodes often suggests abnormal signaling pathways that may be associated with diverse lymphatic disorders. Current clinical biomarkers for histological classification of lymphomas have encountered many discrepancies, particularly for borderline cases. Therefore, we launched a comprehensive proteomic study aimed to establish a proteomic landscape of patients with various lymphatic disorders and identify proteomic variations associated with different disease subgroups. In this study, 109 fresh-frozen lymph node tissues from patients with various lymphatic disorders （with a focus on Non-Hodgkin’s Lymphoma） were analyzed by data-independent acquisition mass spectrometry. A quantitative proteomic landscape was comprehensively characterized, leading to the identification of featured protein profiles for each subgroup. Potential correlations between clinical outcomes and expression profiles of signature proteins were also probed. Two representative signature proteins, phospholipid-binding proteins Annexin A6 （ANXA6） and Phospholipase C Gamma 2 （PLCG2）, were successfully validated via immunohistochemistry. We also evaluated the capability of acquired proteomic signatures to segregate multiple lymphatic abnormalities and identified several core signature proteins, such as Sialic Acid Binding Ig Like Lectin 1 （SIGLEC1） and GTPase of immunity-associated protein 5 （GIMAP5）. In summary, the established lympho-specific data resource provides a comprehensive map of protein expression in lymph nodes during multiple disease states, thus extending the existing human tissue proteome atlas. Our findings will be of great value in exploring protein expression and regulation underlying lymphatic malignancies, while also providing novel protein candidates to classify various lymphomas for more precise medical practice. 

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