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该研究利用通过一步组装合成的石墨化碳掺杂二维介孔二氧化钛纳米花（2D-GC-mTNS）作为基质，辅助激光解吸电离质谱。得益于二维介孔二氧化钛和石墨化碳的协同增强代谢物离子化作用，该研究建立了分析时间短、灵敏度高、重现性好的代谢物分析方法，并将该方法应用于大样本肠炎尿液的代谢指纹图谱分析，筛选出特征代谢物，建立了肠炎的预测诊断模型。

研究背景

肠炎（Inflammatory bowel disease, IBD）是严重威胁公共健康的肠道系统疾病，全世界每年约有680万例新发病例。目前的肠炎筛查诊断技术包括内窥镜、结肠镜、上消化道造影、胃肠道取样等，这些技术由于具有侵入性、耗时久、成本高等原因，严重影响了患者主动检查的积极性，导致诊治延误。然而，肠炎没能得到及时治疗，往往会演化为肠出血、结肠癌、直肠癌等更为复杂的疾病。因此，我们迫切需要发展一种快速、高效、非侵入性的诊断方法。代谢物是比基因和蛋白更接近表型的生物分子，它在发展疾病标志物、用于疾病的精准诊断和作为治疗靶点等临床应用中发挥着越来越重要的作用。以尿液作为代谢物研究的样本具有非侵入性、易于取样、取样成本低等优点。疾病标志物会经血液系统进入尿液，而尿液系统没有稳态平衡机制，这些疾病标志物分子更容易在尿液中积累，这使得尿液成为疾病标志物的重要样本来源并逐步被用于各种病变的检测和诊断。因此，对肠炎尿液中的代谢指纹图谱进行分析，有望能获得有用的代谢物信息，建立肠炎的预测诊断模型。

基质辅助激光解吸离子化质谱技术（Matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry, MALDI MS）由于其操作简单、通量高的特点而在生物分析，尤其是核酸和蛋白等生物大分子的分析中得到广泛应用。此外，微升级的样品消耗量和数秒内的分析速度使得MALDI MS在临床应用中具有广阔的前景。然而，MALDI MS分析方法用于代谢物的分析却面临着有机物基质自解吸产生背景信号干扰代谢物检测，以及由于生物样品组成复杂而往往需要在MALDI MS分析前进行样品前处理的问题。采用合理设计的纳米材料替代传统有机物基质作为MALDI基质，可以解决上述问题。二氧化钛具有良好的导电性、热驱动的分子解吸性能、强紫外吸收能力，以及拥有低成本和易于制备等优点；石墨化碳导电性好，结晶度好、化学稳定性好，并且在激光照射下具有很好的结构稳定性和降低背景信号的能力；多孔结构的引入既可以增加基质对代谢物的吸附表面积，又可以通过体积排阻效应避免大分子物质对代谢物检测的干扰；二维结构可以提供更大的吸附面积和更均匀的表面，这些都是影响MALDI MS检测性能的重要因素。受此启发，该研究制备石墨化掺杂二维多孔二氧化钛材料用于MALDI MS分析，这也有望发展对代谢物的高灵敏快速分析方法。

研究结果

研究分三个阶段进行，分析流程图如图1所示。

图1 研究流程示意图

2D-GC-mTNS的构筑和调控

该研究通过一步组装法合成了石墨化碳掺杂花瓣状二维介孔二氧化钛材料，并调控反应条件制备了4种不同花瓣致密程度的2D-GC-mTNSs。研究发现，适度的花瓣间距有助于增强代谢物的离子化能力。2D-GC-mTNS比表面积高达219.12 m2∙g-1，具有孔径为39.96 Å的介孔结构，其组成中石墨化碳的含量为24.37% (w/w)。此外，2D-GC-mTNS表面富含亲水性羟基，有利于提高其在生物样本中的分散能力，并且材料在MALDI MS激光发射波长355 nm处显示出强的紫外吸收能力，说明其具有良好的吸收激光能量用于代谢物离子化的能力（图2）。

图2 2D-GC-mTNS的表征和表面性质研究

2D-GC-mTNS辅助MALDI MS分析能力的研究

该研究首先采用一系列代谢物标准品作为分析对象，探索了2D-GC-mTNSs辅助MALDI MS分析的能力（图3），同时以氧气下焙烧的2D-mTNSO、石墨烯、商品化二氧化钛材料金红石和P25，以及两种常见有机基质CHCA和DHB作为对比。结果显示以2D-GC-mTNS作为基质时具有最干净的背景吸收和最强的代谢物分析信号。进一步的考察结果显示，基于2D-GC-mTNS的MALDI MS分析方法具有较高的灵敏度（fmol∙μL-1）、较强的盐和蛋白耐受性（0.5 mol∙L-1 NaCl 和20 mg∙mL-1 牛血清蛋白）和较好的重现性。随后该研究检验了所建立的代谢物分析方法的定量能力，结果表明代谢物浓度与质谱信号强度呈良好的线性关系。以上研究说明了2D-GC-mTNS辅助MALDI-MS检测到的代谢物在样本中的表达水平具有可靠性，基于这些代谢物信号进行疾病诊断具有可行性。

图3 2D-GC-mTNS辅助MALDI MS分析代谢物的能力检验

尿液代谢物指纹图谱分析和肠炎诊断预测的研究

该研究用所建立的方法分析了138个尿液样本，其中包括71例健康对照者和67例IBD患者，实现了这些尿液样本在m/z 50 ~ 1000 Da的代谢指纹图谱提取（图4）。该研究中，每次仅用0.5 µL尿液样本直接进行质谱检测，不经任何样品前处理操作。为了避免模型的过度拟合，138个样本被随机分为包含88名受试者的训练集（IBD患者/对照，42/46）和包含50名受试者的验证集（IBD患者/对照，25/25）进行分析。经过对线性支持向量机（Linear SVM）、偏最小二乘判别分析（PLS-DA）和随机森林（Random forests）三种模型的优化对比后，选用随机森林模型研究代谢物在IBD患者和健康对照两个组别之间的差异，最终筛选得到41个特征代谢物。根据这些特征代谢物，可以成功将IBD患者从健康对照者中识别出来，在训练集和验证集中的ROC曲线的曲线下面积（AUC）分别为0.972和0.981，具有较高的预测准确度（图5）。对特征代谢物的代谢通路分析结果发现，所鉴定到的代谢物和IBD的病理变化密切相关，说明将这些特征代谢物用于IBD的诊断具有很强的科学合理性，也说明基于2D-GC-mTNS的MALDI MS方法具有很强的代谢物分析能力。

图4 肠炎代谢物指纹图谱分析和模型优化

图5 特征代谢物的筛选和预测诊断模型的建立

研究结论

该研究制备了一种石墨化碳掺杂二维介孔二氧化钛纳米结构（2D-GC-mTNS），将其作为MALDI MS的基质，发展了基于2D-GC-mTNS的MALDI MS代谢物快速分析方法。2D-GC-mTNS只需要简单的制备步骤即可以实现多功能的结构和形态，并提高了对代谢物的离子化能力。研究所建立的代谢物分析方法具有背景噪声小、灵敏度高、耐盐和蛋白质干扰能力强的优势。该方法于数秒钟内即可完成尿液代谢指纹图谱提取，只需消耗0.5 µL尿液且无需任何样品前处理。将该方法应用于IBD尿液中的代谢指纹图谱提取，结合机器学习，研究者们建立了IBD的预测诊断模型，实现了对训练集和验证集中IBD患者的高准确度预测。基于2D-GC-mTNS的MALDIMS代谢物分析方法有望用于大规模、快速、无创的肠炎以及其它疾病的诊断。

Abstract

Due to inefficient diagnostic methods, inflammatory bowel disease (IBD) normally progresses into severe complications including cancer. Highly efficient extraction and identification of metabolic fingerprints are of significance for disease surveillance. In this work, we synthesized a layered titania nanosheet doped with graphitized carbon (2D-GC-mTNS) through a simple one-step assembly process for assisting laser desorption ionization mass spectrometry (LDI-MS) for metabolite analysis. Based on the synergistic effect of graphitized carbon and mesoporous titania, 2D-GC-mTNS exhibits good extraction ability including high sensitivity (< 1 fmol µL−1) and great repeatability toward metabolites. A total of 996 fingerprint spectra were collected from hundreds of native urine samples (including IBD patients and healthy controls), each of which contained 1220 m/z metabolite features. Diagnostic model was further established for precise discrimination of patients from healthy controls, with high area under the curve value of 0.972 and 0.981 toward discovery cohort and validation cohort, respectively. The 2D-GC-mTNS promotes LDI-MS to be close to clinical application, with rapid speed, minimum sample consumption and free of sample pretreatment.

复旦大学附属中山医院沈锡中教授团队成员吴昊医师、孙念荣副研究员和复旦大学化学系邓春晖教授为该论文的通讯作者。该研究得到了国家重点研发项目、国家自然科学基金和上海杨帆计划的资助。

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