研究人员对胰岛单细胞数据库中的胰岛β细胞亚群进行了提取，利用拟时序算法对二型糖尿病进展中的胰岛β细胞转录组变化轨迹进行重构，进一步从标记基因和系统生物学的角度对胰岛β细胞二型糖尿病进展中的轨迹方向进行了区分和定义，为二型糖尿病的发生发展过程提供了全新的视角，为药物靶标的开发和生活方式的指导提供了理论依据。

图1 Phenomics期刊2021年第5期封面

研究背景 

在过去的五十年中，全球范围内的二型糖尿病（Type 2 Diabetes, T2D）患病人数持续增加，并呈现出向亚、非洲等发展中国家蔓延的趋势。

与先天性胰岛素分泌不足导致的一型糖尿病（Type 1 Diabetes, T1D）相比，二型糖尿病由外周器官如肝脏、肌肉、脂肪等的胰岛素抵抗（Insulin Resistance, IR）引发。外周器官的胰岛素抵抗降低了外周器官的血糖摄取能力，而居高不下的血糖水平不断刺激胰腺β细胞进一步生产释放更多的胰岛素，加重的胰岛素生产负担进而加速了胰岛β细胞氧化应激，导致细胞凋亡，从而加速了二型糖尿病进展。

由此可见，了解胰岛β细胞在二型糖尿病进程中的维持与转变非常重要，但目前我们获得的大部分见解都来自胰腺整体，而缺乏对胰腺异质性及单一β细胞类群在T2D疾病进程中的认识。

随着微流控技术的运用，单细胞测序的通量得到了极大的提升。但在之前的研究中，胰岛β细胞缺乏清晰的疾病相关亚群分型，这提示在T2D进程中，胰岛β细胞可能经历渐进的转变过程。为验证猜想，研究团队对公共数据库中的人类胰岛单细胞测序数据进行分析。

研究结果

为了验证胰腺β细胞在T2D进展中的具有疾病相关的渐进变化，研究团队对公共数据库中来自健康人类（n=6）和糖尿病患者（n=3） 共9个人类供体的胰岛单细胞测序数据进行了亚群细分并进行了β细胞亚群的提取，进一步使用了拟时序分析以研究T2D进展中胰岛β细胞的连续变化。

图2 拟时序分析确定了β细胞三种状态。（A）三种拟时序分析的到的β细胞状态分别被标记为正常（Normal），肥胖样（Obesity-like）以及二型糖尿病样（T2D-like）；（B）健康人和T2D供体细胞在拟时序轴上的分布情况；（C）各分支中细胞来源占比；（D）各分支标志基因表达情况；（E）不同供体中三种类型细胞占比。

拟时序分析结果显示T2D进展中胰腺β细胞存在异质性，并将β细胞大致分为三条分支（图2A），而三条分支供体来源呈现出较大差别，例如左下角分支中，来自T2D病人供体细胞占据大多数，而另外两条分支，则兼具了来自病人和健康人供体的细胞（图2B，2C）。 

为了进一步研究各分支转录组水平差异，研究人员观察了T2D过程中重要的相关基因在三条分支中的表达量水平变化（图2D），发现在T2D供体细胞富集分支中，大量内质网应激（ER Stress）、氧化应激、细胞凋亡相关通路被显著上调，而呈现一定的二型糖尿病特征（T2D-like）；而右下角分支则显著高表达胰岛素mRNA（INS），呈现出较高的胰岛素生产压力，但较低水平的应激相关基因则说明该分支细胞并不处于应激状态，具有一定的“肥胖样特征”（Obesity-like），即胰岛素高表达，但未对细胞生存产生压力。

而中间上部的细胞分支在胰岛素表达和应激相关基因水平上都显示出较为居中的表达水平，且相对高表达了一系列被认为同胰岛β细胞维持正常功能相关基因，在各方面都呈现相对正常的生理状态（Normal）。而不同供体中来自不同分支的细胞比例呈现出明显不同，例如在T2D病人中，来自T2D-like分支的细胞占比最高。

但在健康人3号供体中，T2D-like分支细胞占比与T2D病人类似，提示健康人3号可能具有高T2D风险，同时健康人3号样本来自女性供体，这可能也表明了胰岛β细胞转录组的性别差异。

随后，研究人员对于三条分支之间的差异表达基因进行了总体分析。研究团队对各分支间的差异基因依据表达模式进行聚类，并对不同聚类中的基因进行富集分析，结果显示，在T2D-like分支中，ER Stress和未折叠蛋白反应（UPR）、氧化应激、细胞自噬和溶酶体途径、细胞凋亡途径均显著上升（图3A, 3D, 3E）；而在Obesity-like分支中，一系列蛋白质合成分泌相关通路以及线粒体形成和呼吸传递链相关的途径得到了显著上调（图3C）；在Normal 分支中，一系列同RNA剪切、蛋白定位、细胞骨架、染色质修饰相关的富集通路也暗示该分支细胞呈现更加“正常”或者更加原始的状态（图3B）。

图3 分析了不同聚类基因表达特征。（A）热图显示了四簇基因在三类细胞中表达模式差异；（B-E）分别显示了簇1（B）、簇2（C）、簇（D）、簇（E）的基因富集结果。

讨论与展望 

本文利用公共数据库数据，研究了胰岛β细胞在T2D进展中的转录组异质性。研究团队利用拟时序分析，重构了T2D进展中胰岛β细胞转录组的变化轨迹，并根据β细胞转录组差异对不同细胞分支性质做出了区分，为T2D进展过程中胰岛β细胞变化提供了崭新视角。

拟时序分析算法在揭示胰岛β细胞转录组连续性变化和重构T2D进程的过程中起到了独特的作用，这提示我们此算法在其他不同类型细胞，包括胰岛其他内分泌细胞及其他不同组织来源细胞的单细胞测序数据连续状态的识别分析中，同样可起一定作用。

同时，本文和相关已发表论著均强调了T2D发病原因多种多样，而不同的生物学样本可能来自于疾病发展的不同时期。因此，为了应对T2D样本在疾病进展时期及遗传背景的异质性，增加样本量可能是较完整地重构疾病发生发展过程的必要条件。

目前，单细胞技术还存在一些缺陷，如低效的mRNA捕获和cDNA的扩增效率差异，可能会导致逆转录和cDNA扩增过程中转录组信息的丢失(drop-out)与偏差（bias）。

随着单细胞技术的不断发展，对于生命活动进行高分辨率观察，为我们进一步探索生命奥秘提供了崭新视角。其所能提供的高分辨率转录组微观表型同病人宏观表型之间的关联机制互相作用的研究，将从多维度对疾病发生发展过程提供精准评估，为药物靶标发现、生活方式指导提供理论依据。

论文通讯作者简介

刘铁民，复旦大学生命科学学院教授，生理学与神经生物学系主任，遗传工程国家重点实验室PI，人类表型组研究院和附属中山医院双聘教授。国家重点研发计划“发育编程及其代谢调节”重点专项项目负责人，中国生物物理学会副秘书长。Journal of Sport and Health Science杂志编委。加拿大多伦多大学博士，哈佛大学医学院贝斯以色列女执事医学中心（HMS/BIDMC）和美国德克萨斯大学西南医学中心（UTSW） 博士后，美国德克萨斯大学西南医学中心讲师。

Phenomics期刊简介

Phenomics是一本新创的同行评审国际期刊，聚焦表型组学前沿研究，搭建全球表型组学领域专家交流的国际平台，推动该领域相关的理论创新和学科发展。

本期刊拥有强大的国际编委团队，复旦大学金力院士担任主编，美国系统生物学研究所Leroy Hood院士、澳大利亚莫道克大学Jeremy Nicholson院士、德国莱布尼兹环境医学研究所Jean Krutmann院士、复旦大学唐惠儒教授共同担任副主编，复旦大学丁琛教授担任执行主编，另有来自全球多国的三十多位著名科学家共同组成编委团队，以及四十多位青年科学家组成青年编委团队。

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文章来源：人类表型组计划公众号