论文DOI链接：

https://link.springer.com/article/10.1007/s43657-021-00023-0

该研究采用以医院体检人群为基础的横断面和纵向研究设计，传统流行病学分析方法发现血清补体C3水平升高与非酒精性脂肪性肝病（Nonalcoholic Fatty Liver Disease，NAFLD）患病风险增加显著相关，而血清补体C4水平升高时却没有发现这种关联。利用遗传流行病学双向孟德尔随机化法（Mendelian Randomization，MR）在验证疾病因果关系能力上较传统流行病学方法更强的优势，本研究将遗传因素作为工具变量，从双向上即SNPs→补体→NAFLD和SNPs→NAFLD→补体，进一步验证血清补体C3、C4水平变化与非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的因果关系，发现非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是导致人体血清补体C3水平升高的原因，而非血清补体C3水平升高是导致非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）疾病风险增高的原因，颠覆了以往传统流行病学的研究发现。因此，可考虑将血清补体C3水平的变化作为非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）患者临床治疗中判断疾病进展严重程度的辅助观察指标。

研究背景

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是最常见的慢性肝病之一。2018年，全球超过四分之一的人口受到非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的影响。随着疾病进程，该病可发展为非酒精性脂肪性肝炎、肝纤维化、肝硬化甚至肝脏肿瘤。研究发现，其发病机制与脂质代谢异常引起的活性氧蓄积、过度氧化应激反应和炎症反应等因素有关。

补体系统作为人体先天免疫防御的一部分，它是一组介导免疫和炎症反应的蛋白质，可参与到抗氧化应激和抗炎症反应过程中。既往研究亦发现，在非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）发生发展过程中，补体系统被激活，并且补体水平与肝脏损伤程度呈平行关系。在补体系统中，补体C3和C4是其重要组成部分之一。

传统流行病学的研究设计在实际实施过程中容易产生一些弊端，从而严重地限制了因果推断的效力。然而，MR分析采用遗传变异作为工具变量来评估待研究暴露因素对疾病的影响，进而做出因果推断结论。该方法可以较好地解决上述传统流行病学设计所产生的弊端，尤其是双向MR分析方法可以验证因果网络的正确方向。

目前，关于补体系统与非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）因果关系的研究证据尚不充分。因此，本文基于广西防城港男性健康队列，在横断面和纵向研究设计基础上，结合双向MR分析方法，探讨血清补体C3和C4与非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）发生发展的因果关系。

图1 研究技术路线

研究方法

1. 研究对象

广西防城港男性健康队列（以医院体检人群为基础）（图1）。

2. 非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的诊断

本研究参照了美国肝病研究协会、美国胃肠病学协会和美国胃肠病学学院的标准。脂肪肝的超声诊断标准包括：①肝脏回声增强或增亮；②肝脏实质回声较肾脏实质强；③肝脏血管模糊；④肝静脉管腔狭窄。此外，在超声诊断基础上并排除以下情况：①过量饮酒史，即纯酒精摄入量＞294 g/week；②既往有肝脏疾病史，自述患有病毒性肝炎（包括乙型病毒性肝炎和丙型病毒性肝炎），或使用与继发性非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）有关的药物（主要包括皮质类固醇、雌激素、胺碘酮、甲氨蝶呤等）或抗肝脏肿瘤相关的药物。

3. 遗传工具变量的选择

（1）补体相关SNPs

基于本课题组前期两阶段全基因组关联研究结果：①补体C3：rs3753394和rs3745567；②补体C4：rs1052693、rs11575839、rs2075799、rs2857009、rs2071278、rs3763317、rs9276606和rs241428。

（2）非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）相关SNPs

基于既往文献报道的全基因组关联分析或者候选基因分析的研究结果，以及在本研究人群的效应：rs738409、rs738491和rs5764455。

（3）遗传风险评分（GRS）构建

本研究采用加性遗传模型方法，将携带风险等位基因的个数分别编码为0、1和2，分别计算个体携带2个补体C3相关SNPs、8个补体C4相关SNPs和3个非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）相关SNPs的风险等位基因之后，构建补体C3、C4和非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的原始GRS和加权GRS作为工具变量。加权GRS计算方法为将个体携带风险等位基因的个数与SNPs效应权重（即回归系数β值）的乘积之和。

研究结果

在本文的横断面研究中，通过与健康对照组相比，非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）组血清补体C3和C4水平分别增高19.44%和9.38%，该组的代谢综合征、中心性肥胖、高脂血症、低高密度脂蛋白胆固醇、高血压、高血糖和胰岛素抵抗患病率较高。经过4年随访，纵向研究的一般人口学特征在新发非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）组和健康对照组之间的差异情况，与横断面研究结果基本相似。

在本文的横断面研究中，校正年龄、婚姻状况、教育程度、吸烟状况、饮酒状况、代谢综合征和胰岛素抵抗后，每增加一个标准差的血清补体C3水平与非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）患病风险增加有统计学关联（OR = 1.65, 95% CI: 1.40, 1.94，P＜0.001），而每增加一个标准差的血清补体C4水平却没有发现这种关联（OR = 1.04, 95% CI: 0.89, 1.21，P = 0.311）。纵向研究亦得出了相似的结果（HRC3 = 1.20, 95% CI: 1.02, 1.42，P = 0.023；HRC4 = 1.10, 95% CI: 0.94, 1.28，P = 0.603）。

本研究通过MR分析发现，在正向研究中无论采用原始或加权GRS_C3作为工具变量, GRS_C3对非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）风险增加的观察效应（βO）与预期效应（βE）之间没有统计学关联（Punweighted = 0.202, Pweighted = 0.322，图2A）；在反向研究中，采用原始或加权GRS_NAFLD作为工具变量，GRS_NAFLD对血清补体C3水平增高的的观察效应（βO）与预期效应（βE）之间有统计学关联（P = 0.004，图2B）。然而，双向MR研究均未发现血清补体C4水平与非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）风险增加有统计学关联（图2C、2D）。

图2 双向孟德尔随机化法分析血清补体C3、C4与非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）风险的因果关系。βO为暴露因素的GRS对相应结局风险的观察效应；βE为暴露因素的GRS对相应结局风险的预期效应。βE = βGE × βEO，其中βGE为暴露因素的GRS（GRS_C3、GRS_C4或GRS_NAFLD）对相应暴露因素（补体C3、C4或NAFLD）的效应大小，βEO为暴露因素（补体C3、C4或NAFLD）对结局风险的效应大小。

多效性分析显示，2个补体C3相关SNPs、8个补体C4相关SNPs和3个非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）相关SNPs均与混杂因素年龄、吸烟、饮酒、中心性肥胖、高脂血症、低高密度脂蛋白胆固醇、高血压、高血糖和胰岛素抵抗没有达到全基因组分析统计学关联（全部P > 0.001）。敏感性分析显示，剔除4个有弱位点效应的补体C4相关SNPs重新构建GRS后，双向MR分析结果与原来结果一致。

讨论及研究意义

杨晓波课题组通过对广西防城港男性健康队列进行横断面和纵向研究，利用遗传流行病学双向孟德尔随机化法（Mendelian randomization，MR）在验证疾病因果关系能力上较传统流行病学方法更强的优势，正向MR表明补体C3/C4水平变化对非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）风险没有因果关系；反向MR则发现，非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的发生对补体C3水平升高存在因果关系，而对补体C4水平升高没有因果关系。由脂肪肝引起的肝脏损伤和功能障碍，会导致过度氧化应激和炎症反应的发生，从而降低补体C3和C4的正常合成，并增加两者的消耗量，进而导致非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）患者中这些补体蛋白含量的下降。这种恶性循环最终会削弱补体C3和C4对非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的抗炎作用，导致疾病进一步发展恶化。因此，该研究结果证实非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是导致人体血清补体C3水平升高的原因，而非血清补体C3水平升高是导致非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）疾病风险增高的原因，为遗传因素决定的补体C3、C4与非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）之间的因果关系提供了新的证据，血清补体C3水平的变化可考虑作为非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）患者临床治疗中判断疾病进展严重程度的辅助观察指标。

Abstract

The complement system is activated during the development of nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD). We aimed to evaluate the causal relationship between serum C3 and C4 levels and NAFLD. After exclusion criteria, a total of 1600 Chinese Han men from the Fangchenggang Area Male Health and Examination Survey cohort were enrolled in cross-sectional analysis, while 572 participants were included in the longitudinal analysis (average follow-up of 4 years). We performed a bidirectional Mendelian randomization (MR) analysis using two C3-related, eight C4-related and three NAFLD-related gene loci as instrumental variables to evaluate the causal associations between C3, C4, and NAFLD risk in cross-sectional analysis. Per SD increase in C3 levels was significantly associated with higher risk of NAFLD (OR = 1.65, 95% CI 1.40, 1.94) in cross-sectional analysis while C4 was not (OR = 1.04, 95% CI 0.89, 1.21). Longitudinal analysis produced similar results (HRC3 = 1.20, 95% CI 1.02, 1.42; HRC4 = 1.10, 95% CI 0.94, 1.28). In MR analysis, there were no causal relationships for genetically determined C3 levels and NAFLD risk using unweighted or weighted GRS_C3 (βE_unweighted = −0.019, 95% CI −0.019, −0.019, p = 0.202; βE_weighted = −0.019, 95% CI −0.019, −0.019, p = 0.322).Conversely,serum C3 levels were significantly effected by the genetically determined NAFLD (βE_unweighted = 0.020, 95% CI 0.020, 0.020, p = 0.004; βE_weighted = 0.021, 95% CI 0.020, 0.021, p = 0.004). Neither the direction from C4 to NAFLD nor the one from NAFLD to C4 showed significant association. Our results support that the change in serum C3 levels but not C4 levels might be caused by NAFLD in Chinese Han men.

论文通讯作者简介

杨晓波，现任广西科技大学副校长、医学部主任兼书记，广西医科大学教授、博士生导师。研究领域主要集中于环境有害因素与健康损害的分子流行病学和遗传流行病学，牵头建立了职业锰暴露工人队列、出生队列、男性健康队列。曾获教育部新世纪优秀人才、教育部霍英东青年教师基金、广西首届杰出青年基金、广西自然科学基金创新团队带头人。

主持国家自然科学基金项目5项、教育部课题 3项、广西省级课题6项，作为核心骨干参与国家科技重大专项、科技部重点研发计划各1项。2019年获省级广西科技进步奖二等奖；2019年获第二届中国环境与健康大会特殊贡献奖；2017年获省级第十四届广西青年科技奖；2016年获得中国毒理学会神经毒理专业委员会学术年会优秀大会报告奖。近5年在本研究领域发表SCI论文49篇 ，合计被引次数500余次，总影响因子累计197，单篇影响因子达5分以上的文章共计13篇，第一作者或通讯作者SCI论文共31篇，包括AJCN，Environ Int，Environ Pollut,Sci Total Environ，Chemosphere等领域核心杂志。

现任中国环境诱变剂学会环境与神经退行性疾病专委会副主委、青委会常委，中国医师协会公共卫生医师分会常委，中国毒理学会神经毒理专委会常委，中国老年学和老年医学学会抗衰老分会常委，广西预防医学会副会长、劳动卫生与职业病专委会主任委员，《中国职业医学》、《中国公共卫生》杂志编委。

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