近日，《表型组学》（Phenomics）在线发表了复旦大学基础医学院任士芳与顾建新团队、人类表型组研究院王久存与刘晶团队联合发表的题为“α2,3-Sialylation with Fucosylation Associated with More Severe Anti-MDA5 Positive Dermatomyositis Induced by Rapidly Progressive Interstitial Lung Disease”的研究论文。

该研究通过仿生糖组学定量技术研究了皮肌炎血浆全糖组特征，鉴定了MDA5阳性皮肌炎合并急性进展期肺间质疾病（MDA5+DM-RPILD）的糖型特征，发现了含α2,3-唾液酸基团的岩藻糖型糖链具有作为RPILD诊断以及MDA5+DM生存预测生物标志物的潜力，为MDA5+DM-RPILD的机制研究提供了新的分子基础和视角。

引用格式：

Zhang, R., Guo, L., Sha, J. et al. α2,3-Sialylation with Fucosylation Associated with More Severe Anti-MDA5 Positive Dermatomyositis Induced by Rapidly Progressive Interstitial Lung Disease. Phenomics (2023).

研究背景

皮肌炎（DM）是一种与多种肌炎特异性抗体（MSAs）相关的临床异质性自免病，其中与抗黑素瘤分化相关基因5抗体阳性相关的皮肌炎（MDA5+DM）是其独特的一种亚型。MDA5+DM的临床特征通常包括皮肌炎特征性皮疹、无或低肌炎累及和显著性的肺间质性疾病（ILD）并发，通常以快速进展性（RPILD）为主。MDA5+DM也是DM所有亚型中死亡率最高的一种，主要是因为其高风险并发RPILD。因为RPILD发病时间较短且容易对肺部造成严重损伤，以及目前缺乏有效控制其发展进程的治疗方法，所以往往导致不良预后和高死亡率。糖基化修饰是常见的蛋白质翻译后修饰，其可通过改变蛋白质的结构和功能进而影响细胞间的信号传导、黏附和迁移等过程。蛋白质的糖基化修饰在机体免疫应答中发挥着重要的作用，前期多项研究表明大多数参与机体免疫应答的关键分子都是糖蛋白，且异常糖基化修饰在多种自免病中都有所报道。然而N-糖基化与皮肌炎，尤其是MDA5+DM之间的关系目前还缺乏相关的研究。因此，在该研究中，作者研究了血浆全糖组与皮肌炎，尤其是MDA5+DM-RPILD之间的关联，揭示DM相关N-糖基化表型特征，并考察了其作为MDA5+DM诊断和预后标志物的潜力。

研究结果

该文章利用研究团队前期开发的一种通过一步还原反应为糖组中每个糖都引入相差3Da的仿生糖内标的定量技术（仿生糖组内标定量法）实现对94例DM患者和168例健康患者全血浆蛋白N-糖组的研究（图1A）。然后根据糖链结构组成的基本特征，包括糖链结构所含天线数目的多少以及唾液酸化修饰、岩藻糖基化修饰、分支型糖链修饰和半乳糖基化修饰程度等，计算对应的糖链派生特征以更全面考察糖基化修饰的整体情况（图1B）。

图1 N-糖组定量分析的简要工作流程及具有代表性的糖链结构组成

（A）研究中用于分析皮肌炎患者全血浆蛋白N-糖组（TPNG）的仿生糖组（Bionic Glycome）方法示意图；（B）糖基化派生特征计算所依据的具有代表性的的聚糖组成

1. MDA5+DM中并发RPILD与non-RPILD的全血浆蛋白N-糖组差异

为了探索全血浆蛋白N-糖组与MDA5+DM并发肺间质性疾病严重程度的相关性，根据不同程度的肺间质疾病，MDA5+DM亚型分成了两类：并发快速进展性肺间质病变的MDA5+DM（MDA5+DM-RPILD）和非快速进展性肺间质病变的MDA5+DM（MDA5+DM-nonRPILD）。通过逻辑回归以性别和年龄做为协变量的方法研究比较MDA5阳性并发RPILD，MDA5阳性并发非RPILD和MDA5阴性并发非RPILD这三组的全血浆蛋白N-糖组的差异。

与非快速进展性肺间质疾病的MDA5+DM相比，快速进展性肺间质疾病的MDA5+DM组中复合型糖链结构的水平显著升高，其中两天线和三天线糖链结构水平也显著升高。除此之外，还发现岩藻糖基化修饰水平在快速进展性肺间质疾病组也显著升高。通过数据看出，总的不饱和半乳糖基化修饰水平显著升高即半乳糖基化修饰水平表现为下降。但是对于末端无唾液酸化修饰的岩藻糖基化的双天线糖链结构而言，其半乳糖基化水平在快速进展组呈现显著升高，如图2A所示。

针对唾液酸化糖型的特征研究（图2B），则发现MDA5+RPILD组相对于non-RPILD组其唾液酸化修饰水平呈整体下降。但有趣的是，分别比较不同连接类型的唾液酸化修饰时，只有α2,3-唾液酸化修饰水平在MDA5+快速进展性肺间质疾病中显著降低，而α2,6-连接的唾液酸化修饰水平在两组中却没有发现显著性差异。

此外，H6N5S3这一类糖链修饰水平在MDA5+RPILD组高于在MDA5+non-RPILD组。具有岩藻糖基化修饰的由5个己糖、4个N-乙酰葡糖胺、1或2个唾液酸组成的糖型（H5N4FSx）相较于MDA5+DM-nonRPILD组，在MDA5+DM-RPILD中也呈显著升高（图2C）。但与MDA5抗体阴性非快速进展性肺间质组比较，研究发现在同为非快速进展性时，抗体阳性组别中的唾液酸化修饰水平显著降低。而MDA5阴性non-RPILD与MDA5阳性RPILD比较的时候，发现与之前不同的是在MDA5阳性RPILD中单天线结构糖链水平显著升高，如图2B所示。

图2 MDA5+DM-RPILD、MDA5+DM-nonRPILD和MDA5^-DM-nonRPILD三组的全血浆蛋白N-糖组比较分析所得到的有显著性差异的糖基化衍生化特征箱型图

（A）表示的是有显著性差异的一类常见的糖基化衍生化特征；（B）代表一组有显著性差异的与唾液酸化修饰相关的糖基化衍生化特征；（C）代表了有显著性差异的具有相似结构的糖链特征。箱型图矩形框上下线表示25到75百分位之间，中位数表示为框内的一条线。须线长度范围表示数据中最小-最大的范围。*表示p-value的值: *p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001

2.血浆蛋白N-糖组与MDA5+DM诊断和预后相关

基于现有研究发现，N糖基化与皮肌炎，尤其是抗MDA5阳性亚型之间存在密切的关系，所以进一步利用机器学习的方法构建预测模型，来探索糖基化作为RPILD早诊生物标记物的可能性，分别以直接检测到的糖链相对定量信息和计算得到的衍生化特征信息作为预测变量建模，来评估N-糖基化修饰特征对MDA5+DM亚型中RPILD和non-RPILD的识别能力，并且同时还在更大的样本量即所有的DM样本中去验证所构建的预测模型的区分效果，如图3所示。

图3 以N-糖基化特征为预测变量构建模型的基本流程示意图

利用受试者工作特征曲线的AUC值来评估模型的灵敏度和敏感性。该研究发现直接检测到的糖链结构作为预测变量所构建的模型对应的AUC值为0.922，用计算得到的衍生化特征作为变量构建的预测模型所对应的AUC值为0.934，两者的模型区分能力均比用多种临床指标作为变量所构建的预测模型好（AUC=0.789）（图4A）。此结果在随后的更大样本量的验证中也得到了证实（AUC=0.810，AUC=0.830）（图4B）。对应模型最优预测矩阵如图4C和图4D所示。

图4 预测模型的效果评估。MDA5+DM中以直接检测到的糖链结构、计算得到的衍生化特征和临床指标为预测变量分别建模对应的ROC曲线

（A）、（B）DM中直接检测到的糖链结构、计算得到的衍生化特征和临床指标分别建模对应的ROC曲线，A为训练数集，B为验证数集；（C）、（D）混淆矩阵分别表示在MDA5+DM中使用直接检测到的糖链结构和衍生化特征建模型的分类结果

为了进一步了解N-糖基化特征与MDA5+DM生存预后的相关性，该研究根据上面所构建的模型所对应的方程式结合ROC曲线的截断值，最后根据构建模型得到的方程式，计算每个样本对应的N-糖基化得分，然后按照阈值划分高分组和低分组，结合临床信息，研究N-糖基得分与MDA5阳性患者生存预后的相关性，然后利用Kaplan-Meier方法进行生存分析发现无论是N-糖链分值还是N-糖链衍生化分值，高分值组的病人往往伴随着更差的预后（p=3e-04和p=0.0064，图5A，B），低分组具有生存优势。

图5 N-糖基化得分与MDA5+DM患者生存预后的相关性分析

研究结论

研究利用研究团队之前开发的仿生糖组内标定量法对皮肌炎患者血浆样本进行全血浆蛋白N-糖组分析。此前皮肌炎与N-糖基化之间的关系还尚未有相关的报道，该研究首次揭示了皮肌炎的异常糖基化，提示N-糖基化与MDA5+DM中ILD所引起的疾病严重程度相关，同时可能是MDA5+DM中RPILD早期诊断和生存评估的潜在生物标志物。该研究较全面揭示了MDA5+DM与N-糖基化的关系，为未来从N糖基化角度进一步深入探索MDA5阳性DM潜在的分子机制提供了新思路。 

复旦大学基础医学院、卫健委糖复合物重点实验室任士芳教授、顾建新教授和复旦大学人类表型组研究院刘晶青年副研究员为该论文的通讯作者，并得到了王久存教授的指导。复旦大学基础医学院研究生张榕榕和复旦大学人类表型组研究院研究生郭丽为该论文第一作者。该研究这项工作得到了国家重点研发计划（2022YFC3400803）、国家自然科学基金（32071276）、大湾区精准医学研究院（IPM2021C005）和国家创新人才博士后计划（BX20190076）的资助。

Abstract

Dermatomyositis (DM) is a heterogeneous autoimmune disease associated with numerous myositis specifc antibodies (MSAs) in which DM with anti-melanoma diferentiation-associated gene 5-positive (MDA5+DM) is a unique subtype of DM with higher risk of developing varying degrees of Interstitial lung disease (ILD). Glycosylation is a complex posttranslational modifcation of proteins associated with many autoimmune diseases. However, the association of total plasma N-glycome (TPNG) and DM, especially MDA5+DM, is still unknown. TPNG of 94 DM patients and 168 controls were analyzed by mass spectrometry with in-house reliable quantitative method called Bionic Glycome method. Logistic regression with age and sex adjusted was used to reveal the aberrant glycosylation of DM and the association of TPNG and MDA5+DM with or without rapidly progressive ILD (RPILD). The elastic net model was used to evaluate performance of glycans in distinguishing RPLID from non-RPILD, and survival analysis was analyzed with N-glycoslyation score by Kaplan–Meier survival analysis. It was found that the plasma protein N-glycome in DM showed higher fucosylation and bisection, lower sialylation (α2,3- not α2,6-linked) and galactosylation than controls. In MDA5+DM, more severe disease condition was associated with decreased sialylation (specifcally α2,3-sialylation with fucosylation) while accompanying elevated H6N5S3 and H5N4FSx, decreased galactosylation and increased fucosylation and the complexity of N-glycans. Moreover, glycosylation traits have better discrimination ability to distinguish RPILD from non-RPILD with AUC 0.922 than clinical features and is MDA5-independent. Survival advantage accrued to MDA5+DM with lower N-glycosylation score (p=3e-04). Our study reveals the aberrant glycosylation of DM for the frst time and indicated that glycosylation is associated with disease severity caused by ILD in MDA5+DM, which might be considered as the potential biomarker for early diagnosis of RPILD and survival evaluation of MDA5+DM.

通讯作者

任士芳

任士芳，复旦大学基础医学院教授，博士生导师，主要从事蛋白质糖基化精准分析方法及其临床应用研究，重点关注肿瘤、衰老和自免病的糖基化特征研究，以第一或通讯作者在Cell Research、Aging Cell和EbioMedicine等期刊发表SCI论文四十余篇。获得中国发明专利授权4项，海外专利申请1项，国际PCT专利申请2项，承担了国家重点研发计划课题、国家自然科学基金，以及参与973和重点研发计划等多个项目，荣获过中国抗癌协会科技奖二等奖和第二届“张树政糖科学奖优秀青年奖”、中国生化学会糖复合物专业分会委员、糖复合物专业委员会青年工作委员会委员和上海市抗癌协会检验医学专业委员会委员。

刘晶

刘晶，现任复旦大学人类表型组研究院青年副研究员、硕士研究生导师。获得博士后创新人才计划（“博新”计划）。致力于自身免疫疾病的发病机制研究，揭示强直性脊柱炎的遗传变异位点、免疫紊乱调控机制以及发现多个药物疗效的分子标志物。以第一/通讯作者在Ann Rheum Dis, Clinic and Trans Med, Rheumaol等期刊发表论文10余篇，获得专利授权2项。主持国家自然科学基金青年基金1项。

顾建新

顾建新，复旦大学特聘教授，复旦大学基础医学院基因研究中心主任，曾任中国生化与分子生物学学会常务理事、卫健委糖复合物重点实验室主任、全国复合糖专业委员会主任委员、国际糖复合物学会中国区代表。担任糖生物学专业期刊Glycoconjugate Journal副主编。先后主持国家重点研发计划精准医学研究专项（首席科学家）、国家自然科学基金重点项目、国际合作项目、面上项目，负责973和两次国家传染病重大专项课题，并参与过863课题等。先后被评为教育部优秀人才、上海市科委优秀学科带头人和上海市曙光学者，享国务院特殊津贴。以通讯作者在 J Clin Invest、Gastroenterology、Cell Res、Hepatology、Cancer Res 和 J Biol Chem 等国际著名期刊发表 SCI 论文 110 余篇。

第一作者

张榕榕

张榕榕，复旦大学生物化学与分子生物学专业硕士研究生，硕士期间加入糖复合物重点实验室，在顾建新教授和任士芳教授课题组内学习。在读期间以共一作者在EbioMedicine、Rheumatology (Oxford)等参与发表了3篇SCI论文。

郭丽

郭丽，上海交通大学医学院附属仁济医院风湿科住院医师，助理研究员，主要从事结缔组织病相关间质性肺病的临床和基础研究，以第一作者在A&R、Rheumatology等杂志发表多篇SCI论文，获得国家自然科学-青年基金1项，2016-2017年以医院公派出国至瑞士苏黎世大学访学1年。

Phenomics期刊简介

Phenomics是一本新创的同行评审国际期刊，聚焦表型组学前沿研究，搭建全球表型组学领域专家交流的国际平台，推动该领域相关的理论创新和学科发展。

本期刊拥有强大的国际编委团队，复旦大学金力院士担任主编，美国系统生物学研究所Leroy Hood院士、澳大利亚莫道克大学Jeremy Nicholson院士、德国莱布尼兹环境医学研究所Jean Krutmann院士、复旦大学唐惠儒教授共同担任副主编，复旦大学丁琛教授担任执行主编，另有来自全球多国的三十多位著名科学家共同组成编委团队，以及四十多位青年科学家组成青年编委团队。

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