虚拟氨基酸突变（Calculate Mutation Energy）教程

目的： 通过此教程，了解Discovery Studio中虚拟氨基酸突变的操作方法及结果分析。

所需功能和模块：Discovery Studio Client，DS CHARMm

所需数据文件：1aq1.pdb，2sta_I.pdb

所需时间：60分钟

介绍

蛋白的氨基酸定点突变可以用于酶与抗体的设计，但是由于进行氨基酸选择时的盲目性而导致效率低下。虚拟氨基酸突变可以通过丙氨酸扫描和饱和突变确定最佳的氨基酸突变组合，从而为实验中的氨基酸定点突变提供指导。

本教程使用Calculate Mutation Energy (Binding)对一个蛋白-配体复合物进行基于相互作用力的虚拟氨基酸突变，确定了活性位点中的关键氨基酸，以及能提高亲和力的氨基酸突变目标。使用Calculate Mutation Energy (Stability)对一个蛋白进行基于热稳定性的虚拟氨基酸突变，预测了能提高蛋白热稳定性的突变目标，并利用Predict Stabilizing Mutations预测了最佳的氨基酸突变组合。

本教程涵盖如下内容：

l  虚拟氨基酸突变提高酶与底物的亲和力

l  虚拟氨基酸突变提高蛋白热稳定性

l  预测提高热稳定性的最佳氨基酸突变组合

虚拟氨基酸突变提高酶与底物的亲和力

在文件浏览器（Files Explorer）中，找到Samples| Tutorials| Receptor Ligand Interaction中的1aq1.pdb，双击打开在分子窗口中显示。

分子窗口中展示出了一个带有配体的蛋白的结构（图1）

在Hierarchy窗口（CTRL+H）中选择Water，点击键盘Delete以删去结晶结构中的结晶水。

在Hierarchy窗口（CTRL+H）中双击1aq1的<Chain>链，将配体重命名为Ligand。

在工具浏览器（Tools Explorer）中，展开Macromolecules | Prepare Protein，点击 Clean Protein对蛋白的结构进行预处理。

然后在工具浏览器（Tools Explorer）中，展开Simulation | Change Forcefield，点击Apply Forcefield，将蛋白赋上CHARMm力场。

在窗口中点击鼠标右键，设置左上角图标Atom Display为Line，以线性方式显示每一个原子。

经过以上这些处理之后，在Hierarchy窗口中单击选中Ligand，然后点击菜单栏Edit | Select，

在弹出的窗口中设置Selection Mode为Replace（New Only），Radius为3，然后点击Apply。（图3）

以选中配体周围3埃内的所有氨基酸作为后续突变点。

选中以后，点击鼠标右键，选择Group，并在弹出的对话框中输入mutation，这样我们就将配体3埃以内的所有氨基酸定义为一个名为mutation的组。

点击mutation选中定义的原子，在工具浏览器（Tools Explorer）中，展开Macromolecules| Design Protein，点击 Calculate Mutation Energy (Binding)。

流程对应参数在参数浏览器中打开。

设置Input Typed Molecule为1aq1:1aq1。

设置Ligand Chain为1aq1:Ligand_2。

设置Mutation Site为Single Mutations。

Mutantion Sites有四个模式可以选择：

Single Mutantions：被选择的氨基酸残基进行单点突变。如果将2个氨基酸残基突变成2种不同的氨基酸类型，将会进行4次独立的突变。

Double Mutantions：被选择的氨基酸残基进行两点同时突变。如果将N个氨基酸残基突变成M种不同的氨基酸类型，将会两两组合，进行[N!/2(N-2)!]( M2 )次突变。

Triple Mutations：与Double Mutantions类似，但进行三点同时突变。

All Selected Residues：将被选择的氨基酸残基同时突变。

本次教程将选择Single Mutantions模式。

接着我们需要在Mutantions参数栏设置氨基酸残基的突变类型。

点击Mutantions参数栏右侧的，弹出如下图所示的对话框。我们这里将之前定义的mutation组中所有的氨基酸突变为ALA。（图5）

即将mutation组中氨基酸进行丙氨酸扫描。

其余参数都采用默认设置。（图6）

点击Run运行该Protocol。

点击Background等待作业完成。

作业完成后，双击作业浏览器（Jobs Explorer）中相应的行，打开Report页面。

在Report页面的Summary栏，会出现一个表格（图7）。该表格是按照突变能(Mutation Energy)从低到高对氨基酸突变的结果进行排序，只展示突变能最高的和最低的各5个氨基酸突变。对于每个氨基酸突变，表格的最右侧一列都有一个Effect评估，如果突变能在-0.5到+0.5之间，那么Effect为neutral，即这种突变对于亲和力没有影响；如果突变能在0.5以上，那么Effect为destabilizing，即这种突变会导致亲和力降低，相互作用关系减弱；如果突变能在-0.5以下，那么Effect为stabilizing，即这种突变会导致亲和力上升，相互作用关系增强。

点击Results栏中Mutation Energy Terms链接。

打开一张含所有突变位点突变信息的表格。（图8）

双击Mutation Energy表头，可按照突变能从低到高排列。

可以看到Val18、Phe80、Phe82、Ile10、Leu134和Gly11氨基酸突变为ALA之后会导致亲和力降低，推测这些氨基酸是受体与配体相互作用的关键氨基酸。

回到1aq1的分子窗口，在Hierarchy窗口（CTRL+H）中选择Val18、Phe80、Phe82、Ile10、Leu134和Gly11这6个氨基酸，点击鼠标右键选择Group，命名为keyresidues。（图9）

在工具浏览器（Tools Explorer）中，展开Macromolecules| Design Protein，点击 Calculate Mutation Energy (Binding)。

流程对应参数在参数浏览器中打开。

设置Input Typed Molecule为1aq1:1aq1。

设置Ligand Chain为1aq1:Ligand_2。

设置Mutation Site为Single Mutations。

点击Mutantions参数栏右侧的，弹出如下图所示的对话框，将之前定义的keyresidues组中所有的氨基酸突变为其余19种标准氨基酸（右侧ALL中除了ASPH、GLUH、LYSN、ARGN、HSC之外的所有氨基酸）。（图10）

即将keyresidues组中氨基酸进行饱和突变。

其余参数采用默认设置。（图11）

点击Run运行该作业。

点击Background等待作业完成。

作业完成后，双击作业浏览器（Jobs Explorer）中相应的行，打开Report页面。

点击Results栏中Mutation Energy Terms链接。

打开一张含所有突变位点突变信息的表格。（图12）

双击Mutation Energy表头，可按照突变能从低到高排列。

在结果中可以看到，当Val18突变为His或Ile可以使得受体配体之间的亲和力有所提高。这些突变目标的预测，可以指导我们进行合理的氨基酸突变，从而可能提高酶的活力。

多点同时突变提高酶与底物的亲和力

回到1aq1的分子窗口，在Hierarchy窗口中选中Ile10、Phe80、Phe82这三个氨基酸。

在工具浏览器（Tools Explorer）中，展开Macromolecules| Design Protein，点击 Calculate Mutation Energy (Binding)。

流程对应参数在参数浏览器中打开。

设置Input Typed Molecule为1aq1:1aq1。

设置Ligand Chain为1aq1:Ligand_2。

设置Mutation Site为Triple Mutations。

Mutation Sites设为Triple Mutations，最终的输出结果将是三个氨基酸突变的组合。

点击Mutantions参数栏右侧的，在弹出的对话框中选择如下突变方式：Ile10>Gln、Val18>Ile、Leu134>Asn。

其余参数采用默认设置。（图13）

点击Run运行该作业。

点击Background等待作业完成。

作业完成后，双击作业浏览器（Jobs Explorer）中相应的行，打开Report页面。

点击Results栏中Mutation Energy Terms链接。

打开一张三点突变信息的表格。（图14）

双击Mutation Energy表头，可按照突变能从低到高排列。

三点同时突变后，突变能为-1.21，亲和力增强。通过多点同时突变技术，我们能够考虑多点突变的协同效应对亲和力的影响。

虚拟氨基酸突变提高热稳定性

在文件浏览器（Files Explorer）中，找到Samples| Tutorials| Protein Modeling中的2sta_I.pdb，双击打开在分子窗口中显示。

分子窗口中展示出了一个蛋白多肽的结构。（图15）

在工具浏览器（Tools Explorer）中，展开Simulation | Change Forcefield，点击Apply Forcefield，将蛋白赋上CHARMm力场。

在Hierarchy窗口中，选择Pro504-Glu509这6个氨基酸，点击鼠标右键选择 Group将其命名为mutation（图16）。

在工具浏览器（Tools Explorer）中，展开Macromolecules| Design Protein，点击 Calculate Mutation Energy (Stability)。

流程对应参数在参数浏览器中打开。

设置Input Typed Molecule为2sta_I:2sta_I。

设置Mutation Site为Single Mutations。

点击Mutantions参数栏右侧的，在弹出的对话框中，将之前定义的mutation组中所有的氨基酸突变为其余19种标准氨基酸（右侧ALL中除了ASPH、GLUH、LYSN、ARGN、HSC之外的所有氨基酸）。

其余参数采用默认设置。（图17）

点击Run运行该作业。

点击Background等待作业完成。

作业完成后，双击作业浏览器（Jobs Explorer）中相应的行，打开Report页面。

点击Results栏中Mutation Energy Terms链接。

打开一张含所有突变位点突变信息的表格。（图18）

双击Mutation Energy表头，可按照突变能从低到高排列。

从结果中可以看到，Glu509突变为TRP，突变能为-1.54，对应的Effect是Stabilizing，即这种突变会使蛋白的热稳定性提高，而最后一行的Ile506突变为Pro，突变能是8.14，即突变之后整个蛋白的能量提高，对应的Effect是destabilizing，也就是说这种突变会使蛋白的热稳定性降低。