CY 为花菁 (Cyanine) 的缩写，经典的菁染料含有两个含氮杂环，分子内部含有由甲川基 (CH)n 组成的共轭链，n 可为奇数或偶数。吸光度和荧光波长可通过选择聚次甲基桥的长度来控制：越长的花菁素具有较高的吸光度和发射波长 (图 1 所示)。根据链中的碳原子数，菁类由甲川基被分为一甲基 (CY1，n=0)、三甲基 (CY3，n=1)、五甲基 (CY5，n=2) 和七甲基 (CY7，n=3)。

图 1. 经典花菁素结构及发射光谱示意图

CY 染料的分类  

CY 染料分为非磺化花菁和磺化花菁。两者的光谱特性基本相同，在 DNA 和蛋白质的标记中，它们是可互换的，两种均可用于标记生物分子。磺化花菁染料具体水溶性，且不易在水中聚集，是抗体和蛋白标记的第一选择。

图 2. 共聚焦显微镜观察患者肾、肝和肿瘤的组织切片中 Cy5 的摄取情况^[3]

文中所用 Cy5 来自 MCE

CY 活化基团的选择  

根据需要标记的生物分子的可标记基团 (胺基、醛基或巯基) 以及酸碱性，选择相应的活化染料和反应条件。为减少空间位阻影响，CY 染料常做各种修饰，具体如下： 1) Succinimidyl ester (SE) 修饰：该类型 CY 染料可与蛋白的氨基末端或伯胺反应，从而实现包括多肽、抗体等的蛋白标记。标记反应相对于游离酸形式，空间位阻更小，反应更加稳定，高效； 如 Shiqi Huang 等人研制出一种经过修饰的纳米载体，用于治疗因黑色素瘤导致的肺部肿瘤，研究人员用 Cy5-SE 标记了四种修饰的纳米颗粒导入小鼠体内，并观察肺部荧光图像，进而确定纳米颗粒的聚集情况。结果表明，小鼠的肺部有大量的 Cy5-SE 标记的纳米颗粒靶向聚集，延缓了肿瘤的生长，该文章用荧光标记的方法证明了纳米载体抗肿瘤活性实验的可靠性。

图3. CY5-SE 标记四种修饰载体蛋白的荧光图像^[2]

2) Hydrazide (酰肼) 修饰：该类型 CY 染料可与蛋白等生物分子的醛基反应，多用于神经元细胞的电极失踪和神经缝隙连接硏究；该类型 CY 染料还可用于糖基化抗体的标记；如 J.E.Noble 等用 Hydrazide 修饰的 CY3对四种糖基化抗体进行偶联 (半乳糖、唾液酸、N 乙酰氨基葡萄糖和甘露糖)，得到稳定的 CY3-Hydrazide 标记抗体。3) Maleimide (马米酰亚胺) 修饰：该类型 CY 染料可与蛋白等生物分子的巯基反应，实现高效标记。

CY 花菁类染料优点  

1) 光谱窄，信号强；

2) 花菁类染料的摩尔吸光系数高于其他荧光染料；3) 磺化花菁类染料易溶于水，对组织细胞毒性小，适用于动物和细胞实验；

4) 荧光波段在近红外区段的组织透过性更好。

标记反应操作  

以 NHS 活化脂 CY 标记蛋白为例，如下图所示：

图 3. CY 标记蛋白操作流程将蛋白溶液与配置好的染料工作液倒入反应溶剂中 → 用移液器上下轻打混匀 → 常温下静置或轻微混动反应 3-5 个小时 (可过夜) → 反应结束后进行透析除去未标记染料 → 避光放置在 4°C 保存

参考文献

1.. X Shi, Y Jung, LJ Lin, C Liu, C Wu, IKO Cann, Quantitative fluorescence labeling of aldehyde-tagged proteins for single-molecule imaging Nat Methods. 2012 Apr 1;9(5):499-503

3. Arindam Pramanik, Zexi Xu, Shazana H Shamsuddin, et al. Affimer Tagged Cubosomes: Targeting of Carcinoembryonic Antigen Expressing Colorectal Cancer Cells Using In Vitro and In Vivo Models. ACS Appl Mater Interfaces. 2022 Mar 9;14(9):11078-11091.