细胞冻存和复苏是细胞培养中的关键环节，直接影响细胞存活率和活力，关系到后续细胞实验能否按照计划有效地进行。要想做好细胞冻存和复苏，首先请牢记下面这四个字：

慢冻快融！

慢冻快融！

慢冻快融！

冻存细胞时，细胞内外环境中的水会形成冰晶。如果直接将细胞冻存到 -196℃ 的液氮中，由于冻结过程中胞外溶液中的水先结冰，使胞外溶液不断浓缩，引起细胞电解质升高、渗透压改变、脱水及蛋白质变性等，会导致细胞受到机械性损伤。在冷冻保存时，细胞外环境中的水会结冰。冷却速度的不同会导致细胞由于渗透脱水而发生不同程度的收缩。细胞外环境的渗透压随着水结成冰晶而不断升高，冷却速度越慢，细胞内水分通过渗透作用移出细胞的时间就越长。因此，非常缓慢的冷却可能会导致细胞因过度脱水而死亡 (A)。而快速冷却 (C) 会导致细胞内形成冰晶，这会导致细胞在复温时死亡。中间冷却速度 (B) 则可以平衡渗透脱水和细胞内结冰形成的风险，通常可以实现细胞存活率最大化。

如果在冻存液中加入保护剂 (如 DMSO)，可使冰点降低，增加细胞渗透压稳定性。减缓慢速降温过程中的脱水皱缩现象，在缓慢冻结时减少冰晶的生成，使细胞免受损伤[1]。

图 1. 不同冷却速度对细胞存活率的影响。

 而在复苏时，需要快速升温，在 1-2 min 内融化并稀释，这时细胞内外还来不及形成较大的冰晶，也不会使细胞长时间暴露在高浓度的电解质溶液中，从而避免细胞损伤，提高细胞存活率。

了解了慢冻快融的原理，还有哪些 Tips 可以提高冻存和复苏的成功率呢？一起来看看小 M 为大家准备的避坑指南吧！

“天呐细胞都快长爆了，我得赶紧冻起来！”“这次的细胞好像有点少，算了先冻起来吧！”“哎？冻存液好像配少了，算了少放点吧！”“哎呀！昨天细胞放在 -20℃ 忘记转移了，现在再放到 -80℃ 应该也没事吧！”……停！这是妥妥的挖坑行为！那么冻存细胞的最佳时机是什么时候？什么样的细胞浓度合适？要用多少冻存液呢？怎么实现细胞的“慢冻”呢？看小 M 为大家一一揭晓~  

表 1.  细胞冻存避坑指南^[2] 

复苏后第二天发现细胞没有活？好不容易复苏的细胞竟然污染了？怎么才能让细胞满血复活呢？继续和小 M 一起往下看吧！

■ 细胞拿取

尽量减少样品从液氮或 -80℃ 取出到放置在解冻装置中之间被动升温的时间，否则会大大影响细胞活力。如果储存装置和解冻装置相隔较远，可使用装有干冰 (-80°C) 或液氮 (-196°C) 的隔热容器临时保存和运送细胞。

(注意：从液氮中取细胞时要佩戴护目镜和手套，谨防冻伤及冻存管爆炸！)

■ 解冻方式

a) 解冻细胞时需要快速升温 (50~100℃/min) 才能最大保存细胞活力，最优的解冻方式是 37℃ 水浴[3]。从液氮或 -80℃ 取出冻存的细胞后，稍拧松管盖，防止解冻过程中冻存管炸裂。放入 37℃ 水浴中，持续摇晃 1-2 分钟直至解冻。

通常建议在可见冰融化但样品仍然冰冷（~0℃）时立即停止解冻，常见的做法是在只剩下一小片冰时从水浴锅中取出样品。升温至室温或更高温度会增加冷冻保护剂的细胞毒性，这会极大影响细胞活力[1]。

b) 不建议室温解冻细胞，因为这会导致细胞死亡。

c) 为降低污染风险，水浴解冻时冻存管管口要高于水面，避免水流入冻存管，水浴锅中的无菌水也要定期更换。

■ 稀释

解冻后应尽快稀释，以减少 DMSO 的细胞毒性。按照培养基：冻存液 ≥10:1 的比例加入培养基进行稀释，然后离心并更换培养基重悬细胞，这样可以减少由渗透压变化导致的细胞应激。

■ 换液

依据细胞状态，在细胞贴壁后或 24 h 后换液，继续培养。

 Q：为什么我复苏的细胞完全不贴壁？

A：可能是由于细胞冻存前生长状态差或者复苏过程中动作慢，因此一定要挑选生长状态良好、处于对数生长期的细胞进行冻存，操作过程要遵循“慢冻快融”的原则！

 Q：为什么我复苏细胞的时候明明已经贴壁了，第二天再去看发现细胞全死了？

A：可能是细胞冻存之前消化过度，导致细胞凋亡，因此消化细胞时一定要严格控制消化时间哦！

 Q：细胞复苏后只有非常少量细胞贴壁，是不是需要重新复苏？

A：先不要着急丢掉！可以补加血清和细胞因子，或者每隔 2-3 天换新鲜的生长培养基，经过 2-3 次换液后，大部分细胞就能看到明显增殖，此时再按照正常传代操作即可。当然，如果细胞库存充足，或者着急做实验，可以重新复苏一株细胞~

 Q：冻存液配多了，不想浪费，可以留到下次用吗？

A：配好的冻存液在 4℃ 可以暂存 1 周，在 -20℃ 最多可保存一个月。不过最好还是现配现用、避免反复冻融。

本期小 M 为大家介绍了细胞冻存与复苏的相关注意事项，看完小 M 分享的避坑指南，是不是对细胞冻存和复苏的原理以及操作要点了然于心了呢？带着这份指南，一起养出活力满满的细胞吧！ 

参考文献：

[1] Baust JM, et al. Best practices for cryopreserving, thawing, recovering, and assessing cells. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 2017;53(10):855-871.  

[2] Loecker W, et al. Effects of cell concentration on viability and metabolic activity during cryopreservation. Cryobiology. 1998;37(2):103-109. 

[3] Baust,et al. Development and Assessment of a Novel Device for the Controlled, Dry Thawing of Cryopreserved Cell Products. BioProcessing Journal. 2016;15. 30-41.