2017 年，类器官被 Nature Methods 评为生命科学领域年度技术，可谓是潜力无限。之前，小 M 也已为大家介绍过类器官。今天，小 M 又给大家带来了重磅新星：“二代” 类器官，请查收~

类器官是由胚胎干细胞 (ESCs) 或诱导多能干细胞 (iPSCs) 衍生而来的体外 3D 细胞簇，与起源组织具有相似的组织学特征和功能。相比于传统 2D 培养，类器官更具生理相关性，已被广泛用于疾病研究和药物开发。

尽管已有成熟的方法可以构建肿瘤、肠道、心脏和视网膜等多种类器官，但目前的类器官通常仅包含单一种类细胞，缺少体内微环境的复杂性。

例如，肿瘤类器官的培养中通常仅包含癌细胞，缺少肿瘤微环境 (TME) 细胞和肿瘤外部压力 (如缺氧或免疫调节)，使得整个类器官复杂性大大降低，难以研究细胞外基质在驱动癌症类器官表型和药物敏感性中的机制[1][6]。而对于肠道类器官而言，亦是如此。在过去十年中，源自多能干细胞的人肠道类器官  (Human intestinal organoids, HIOs) 提高了我们对人肠道发育和疾病的认识，为研究人类肠道器官发生和生理学提供了有价值的模型，但它们缺乏完全重现人类肠道生物学和疾病复杂性所需的免疫成分，难以模拟人肠道生物学和疾病的复杂性。

图 1. 肠道类器官及肠上皮边界的免疫细胞概述^[1]

A：肠道类器官培养缺乏肠上皮微环境的任何细胞成分。小鼠小肠类器官在体外自发产生两个特化结构域：隐窝样结构域 (The crypt-like domain) 和绒毛样结构域 (The villus-like domain)。B：稳定状态下在肠上皮边界发现的常驻免疫细胞概述。肠上皮包含 αβ T 细胞受体 (TCR)⁺和 γδ TCR⁺上皮内淋巴细胞 (Intraepithelial lymphocytes, IELs)，而肠固有层包含不同亚群的树突状细胞、巨噬细胞、T 细胞、产生 IgA 的浆细胞和固有淋巴样细胞 (Innate lymphoid cells, ILCs) 等等。

虽然类器官仍存在以上种种局限性，但别慌！科学家们已开启了“二代”类器官的新时代！话不多说，快来跟着小 M 来看看首次构建的包含功能性免疫系统的体内类器官吧~

近期，Carine Bouffi 等人 在 Nature Biotechnology 上发表了题为“In vivo development of immune tissue in human intestinal organoids transplanted into humanized mice”的研究成果。作者将人肠道类器官 (HIO) 移植到具有人源化免疫系统的小鼠 (NSGS) 的肾囊下，生成了含有免疫细胞的 HIO。进一步研究发现人类免疫细胞可暂时迁移到粘膜并形成类似于人类肠道淋巴滤泡的细胞聚集体。此外，接触微生物后，上皮微褶皱细胞 (Microfold cells，M cell) 数量增加，导致 HIO 腔中 IgA 抗体的分泌并决定免疫细胞活化[7]。该文成功开发出“二代”肠道类器官(Next-generation HIO system)，下面，且听小 M 来为大家细细解读~

▐  模型构建

实验工作流程如下图所示：

图 2. 人源化小鼠模型验证述^[7]。

将体外 HIO 移植到人源化 (NSGS) 小鼠体内，移植后第 12、16 和 20 周，收集 HIO 和目标组织进行分析 。注: NSGS 小鼠: NOD/Scid Il2rg null Tg (hIL3、hGM-CSF 和 hSCF) 小鼠。

1. HIO 构建

a) 培养人 H1 胚胎干细胞：在 mTESR1 培养基中无饲养层条件下培养 WA-01 细胞。

b) 诱导确定的内胚层：用 Accutase 分离细胞，以每孔 7-10 万 个的细胞密度铺板于基质胶包被的 24 孔板中。达到 80-95% 融合度时，用 100 ng/mL Activin A  处理 3 天。

c) 诱导中后肠球状体形成：用含 500 ng/mL FGF4  和 3 μM CHIR-99021   的后肠诱导培养基处理内胚层 4 天。

d) HIO 生成：将球体铺在基质胶中，用含 100 ng/mL EGF  的肠道生长培养基中持续培养，至产生 HIO。

2. HIO 移植

a) 将体外成熟 28 天的单个 HIO 从基质胶中取出，移植到人源化小鼠肾囊下 (具体手术方法可参考原文献)。

b) 在术后 48 h 内进行监测，第 12 周和第 16 周对小鼠实施，收集组织并分析。

▐  类器官中肠细胞谱系验证

作者对移植的 HIO 进行了肠道细胞细胞标志物染色，发现在 NSGS 小鼠中移植和分化的人肠道类器官中存在所有主要的肠道细胞谱系，证明了 HIO 的成功构建和移植。

图 3. HIO 移植到人源化小鼠体内的肠细胞谱系表达^[7]。

HIO 移植后 12、16 和 20 周时，HIO 切片上的肠道标志物 (红色)、人 CD45 (绿色) 和人 CDH1 (白色) 在 (A) 肠上皮细胞标志物 VIL/Villin、(B) 杯状细胞标志物 MUC2/Mucin2、(C) 潘氏细胞标志物 LYZ/Lysozyme 和 (D) 肠内分泌细胞标志物 CHGA/Chromogranin A) 的共染色。

▐  移植的 HIO 存在免疫细胞浸润

随后，作者通过免疫组化 (IHC) 证明了移植的 HIO 固有层和上皮存在人免疫细胞 (hCD45+ 细胞) 浸润 (图 4A)，并形成与人类胎儿 (图 4B) 或成人肠道免疫类似的细胞聚集体 (图 4C)，说明移植的 HIO 中存在免疫细胞浸润和结构。

图 4. 使用免疫系统人源化小鼠模型将免疫细胞整合到 HIO 中^[7]。

A：移植 HIO 后不同时间点用抗-人 CD45 抗体对 HIO 进行 IHC 染色; B: 用抗-人CDH1 抗体 (蓝色)、抗-人 CD45 抗体 (绿色) 和 DAPI (白色) 对人胎儿肠道进行免疫荧光染色; C: 用抗-人 CD45抗体对成人空肠进行 IHC 染色。

▐  类器官中免疫构成与人胚胎肠道发育类似

作者还进一步通过质谱流式细胞术 (一种将流式细胞技术与质谱分析技术结合在一起的新技术，用于高纬度和高通量单细胞分析）和免疫组化证实 HIO 中存在 GALT 相关 B 细胞和 T 细胞 （参见原文 Fig 2, 3)。此外，作者还发现移植 HIO 中淋巴样结构的时空发育与胎儿肠道中发育的淋巴滤泡相似，具体表现在 T 细胞/B 细胞聚集 (图 5A)、分区 (图 5B)，粒细胞/浆细胞浸润等等 (图 5C-E)。

图 5. 移植的 HIO 中的淋巴样结构与胎儿肠道中的淋巴发育相关性比较^[7]。

A-C: HIO 切片用抗人-CD3 抗体标记 T 细胞 (上)，用抗人-CD4 /CD8 抗体标记 T 辅助细胞/细胞毒性 T 细胞 (中)，用抗人-CD20 抗体标记 B 细胞 (下)。D: H&E 染色显示发育后期 HIO 中的中性粒细胞。E: H&E 染色显示浆细胞，并进行 IHC 染色确认。

▐  病原体侵染后的免疫应答

最后，作者将移植的 HIO 暴露于病原体 (E.coli )，通过检测 M 细胞标志物 GP2，证明了 M 细胞的存在，且与免疫细胞重合 (图 6A-D)，并发现 HIO 的粘液中存在高水平 IgA 抗体 (图 6E)，且 M 细胞和 B 细胞共定位良好 (图 6F)。由此证明 M 细胞具有转运抗原以激活免疫细胞的功能，以及肠道上皮细胞-免疫细胞存在 Cross-talk，即 HIO 上皮和免疫细胞之间的串扰诱导淋巴样结构的形成以及 M 细胞的分化和功能。

图 6. 移植的 HIO 暴露于病原体 (E.coli)后可诱导 M 细胞产生^[7]。

A-C: HIO 切片用抗人-CD45 抗体, 抗人-GP2 抗体, 抗人-MUM1 抗体分别标记免疫细胞, M 细胞和浆细胞。D: GP2 基因表达变化。E: HIO 粘液中的人 IgA 水平变化。F:使用抗人-CDH1、抗人-GP2 和抗人-CD20 进行免疫荧光染色。

本期小 M 为大家介绍了首例肠道“二代”类器官的构建与验证。该研究一定程度上弥补了免疫相关研究的缺陷，为研究肠道发育、相关疾病和药物发现的研究提供了更切实际的的模型。小 M 也相信这项研究也将为其他类器官领域的科学家们和同学们提供新思路~

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参考文献:

[1] Bar-Ephraim YE, Kretzschmar K, Hans Clevers. Organoids in immunological research. Nat. Rev. Immunol. 2020, 20(5): 279-293. 

[2] Sato T, et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 2009 May 14;459(7244):262-5. 

[3] Ootani A, et al. Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche. Nat Med. 2009 Jun;15(6):701-6. 

[4] Clevers H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 2016 Jun 16;165(7):1586-1597.

[5] Kretzschmar K,et al. Organoids: Modeling Development and the Stem Cell Niche in a Dish. Dev Cell. 2016 Sep 26;38(6):590-600. 

[6] LeSavage, B.L., et al. Next-generation cancer organoids. Nat. Mater. 2022, 21, 143-159.

[7] Bouffi C, et al. In vivo development of immune tissue in human intestinal organoids transplanted into humanized mice. Nat Biotechnol. 2023, 41(6): 824-831.