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磁珠是何方神圣? 如何慧眼识“珠”?
生物磁珠一般是具有细小粒径 (μm) 的超顺磁微球。具有以下特点:
1) 超强顺磁性,在磁场中能够迅速聚集,离开磁场后又能均匀分散;
2) 合适且均一的粒径,保证其具有足够强的磁响应性又不会沉降;
3) 丰富的表面活性基团,以便和生物分子偶联,并在外磁场的作用下实现与被待测样品的分离。
图 1. MCE 磁珠组成
A、G、L、A/G 代表 Protein A、Protein G、Protein L 及 Protein A/G;
Anti-HA、Anti-Flag、Anti-c-Myc、Anti-GST 代表 Anti-HA 抗体、Anti-Flag 抗体、Anti-c-Myc 抗体及 Anti-GST 抗体
选磁珠时,首先关注磁珠磁性 (磁吸时间)、粒径 (大小及均一度) 等。其次根据实验目的,选择合适的表面活性基团以及由此衍生的偶联方式、蛋白结合量等。
比如,如果您的目标蛋白带有融合标签,可一步到位选择:
· Anti-HA Magnetic Beads (HY-K0201)
· Anti-Flag Magnetic Beads (HY-K0207)
· Anti-c-Myc Magnetic Beads (HY-K0206)
· Anti-GST Magnetic Beads (HY-K0222)
如果您的目标蛋白带有生物素标记,可选择
· Streptavidin Magnetic Beads (HY-K0208)
如果您有可识别靶蛋白的抗体,可选择
· Protein A/G Magnetic Beads (HY-K0202)
· Protein A Magnetic Beads (HY-K0203)
· Protein G Magnetic Beads (HY-K0204)
· Protein L Magnetic Beads (HY-K0205)
下面以 Protein A/G 磁珠为例,详述 IP 实验步骤、可能存在的问题及解决方法。
■ Step 1——抗原样品制备
制备抗原样品 (细胞裂解物) 是 IP 的第一步,也是关键的一步。正确的细胞裂解液可以稳定天然蛋白质构象、抑制酶活性、最大限度地减少抗体结合位点变性并释放细胞或组织中的蛋白质。一般可选 NP-40、RIPA、Western 及 IP 细胞裂解液等。抗原样品应始终保存在冰上,并将蛋白酶抑制剂 添加到裂解液中以防止蛋白水解。
注 1:Co-IP 实验时,常用 NP-40 等非离子型裂解液,以免破坏蛋白-蛋白相互作用。
注 2:确保目的蛋白在抗原样品中有较高水平表达。
图 2. 培养、收集、裂解细胞,释放靶蛋白
■ Step 2——样本结合
通过此步骤,您将获得磁珠—抗体—抗原样品复合物。磁珠、抗体、抗原样品的加样顺序对靶蛋白得率有一定影响。
图 3. 常见 IP 实验的样本结合步骤
All in one——直接将磁珠、抗体、抗原样品混合到一起;
直接结合——抗体和磁珠先结合,再和抗原样品结合;
间接结合——抗体和抗原样品先结合,再和磁珠结合。
可选步骤 1——抗原样品预处理:为减少非特异性结合,可将抗原样品单独与 Protein A/G 磁珠或同型对照抗体结合。(预处理有助于去除在 IP 过程中可能与抗体或磁珠非特异性结合的分子,从而改善信噪比。)
可选步骤 2——抗体的交联固定:如果不希望抗体与目标蛋白共洗脱,可在直接结合时,使用交联剂将抗体共价连接到 Protein A/G 上。后续使用酸性洗脱法洗脱靶蛋白。
(直接将磁珠、抗体、抗原样品混合到一起,速度最快,但获得的靶蛋白纯度和得率会很低;间接结合靶蛋白得率最高,但在洗脱步骤时,抗体会和靶蛋白一起被洗脱;直接结合,蛋白得率也较高,且可通过交联固定抗体,达到单独洗脱靶蛋白的目的。)
一般情况下,如果靶蛋白丰度较高,直接结合与间接结合差别不大,均可选;如果靶蛋白丰度不高,可选间接结合以获得更高的靶蛋白得率。 样本结合步骤中的结合/洗涤缓冲液也非常重要。一般情况下,您的结合/洗涤缓冲液可以为同一种缓冲液,如 TBST/PBST。另外可通过加入去垢剂 (如 0.5-1% NP-40/TritonX-100/Tween-20)、增加盐离子浓度 (如 250 mM NaCl/1-2 mM DTT/β-ME)、增加洗涤次数等来提高洗杂效率。
■ Step 3——抗原洗脱
一般根据下游应用选择洗脱方法:
图 4. 常见抗原洗脱方法
1) 变性洗脱法:如果下游分析是用免疫印迹 (Western Blot),则通常直接使用 SDS-PAGE Loading Buffer 进行洗脱 (95°C 加热 5 mins)。该缓冲液可使蛋白质变性还原并用于电泳,十分高效,适用于亲和作用的解离。但该方法也会洗脱下抗体等非靶分子,且获得的蛋白不具备生物活性。
2) 酸性洗脱法:0.1 M-0.15 M 甘氨酸 (pH 2.5-3) 是 IP 中最高效的非变性洗脱缓冲液,低 pH 水平可以解离大多数抗体-抗原相互作用。此方法洗脱的样品保持原有的生物活性,可用于后期功能分析。但酸性洗脱不是好的方法,采用该缓冲液可能无法解离某些抗体—抗原相互作用,而且部分抗体对低 pH 环境敏感。
注 1:在洗脱前的接收管中提前加入中和液,可缓解抗体对于低 pH 环境的敏感。注 2:低 pH 水平也可以解离未交联情况下的抗体—Protein A/G 相互作用。如果不希望抗体与靶蛋白共洗脱,可在样本结合步骤时,使用交联剂将抗体共价连接到 Protein A/G 上。而后再用酸性洗脱法洗脱靶蛋白。
3) 竞争性洗脱法:如果靶蛋白带有标签,可用高浓度标签或配体进行竞争性洗脱。如 Flag 标签蛋白,可用 3×Flag peptide 竞争性洗脱,此方法洗脱的样品保持原有生物活性,可用于后期功能分析,而且还没有抗体片段污染。
■ Step 4——WB 验证
设计好实验,优化好条件,配好各种 buffer 和工作液,按照 protocol,小心翼翼的丝毫不敢怠慢,一通操作猛如虎,一看结果。
1) 靶蛋白信号微弱或无信号
灵魂五问:蛋白表达了吗?上样量足够吗?孵育时间充足吗?裂解液选的合适吗?洗脱方法合适吗?
图 5. IP 组信号微弱或无信号,Input 组有条带,IP 组没条带或条带很弱
解决方案详戳 “冬风吹,战鼓擂,蛋白纯化,我怕谁!
2) 高背景值或多条带
a. 优化蛋白上样量,IP 时总蛋白上样量过多可能会造成非特异性结合,建议上样量为 1 mg 左右;蛋白电泳时,优化上样量以观察特定信号;b. 优化洗涤缓冲液,通过向洗涤缓冲液中加入去垢剂 (如 0.5-1% NP-40/TritonX-100/Tween-20)、增加盐离子浓度 (如 250 mM NaCl/1-2 mM DTT/β-ME)、增加洗涤时间、洗涤次数等降低背景;c. 非必需的高强度洗脱缓冲液 (如 SDS-PAGE 上样缓冲液) 将导致多种非特异蛋白 (如Protein A/G 或链霉亲和素亚基) 与抗原一起被共洗脱下来。温和的缓冲液 (如 0.1 M 甘氨酸,pH 2.5) 可以防止此类污染;d. 抗体污染问题:参考前面关于抗体交联固定的讨论或使用不同种属的一抗进行 IP 和蛋白质免疫印迹检测;e. 使用恰当的蛋白酶抑制剂,防止蛋白降解;
f. 对抗原样品预处理 (将抗原样品单独与 Protein A/G 磁珠或同型对照抗体结合),可减少部分非特异性结合。
3)阳性及阴性对照设置
成功的条带总是相似的,失败的条带各有各的不同。分析结果时,有阴性、阳性对照能一步到位帮您分析原因。
阳性对照:证实细胞裂解物中确实存在靶蛋白 (IP) 或者互作蛋白对 (Co-IP,比如诱饵蛋白 X 和靶蛋白 Y),即为常说的 input。可直接使用细胞裂解物或者抽提好的蛋白溶液进行 Western Blot。
阴性对照:IP/Co-IP 后靶蛋白或者互作蛋白对都检测到了,固然是值得高兴的,但是这结果是不是假阳性呢?还得做个阴性对照。例如,同型对照抗体 (没有特异靶标的一抗,但在类别和亚型上,其跟实验应用中的靶标一抗一致) 等。
Output:在某些 Co-IP 实验中,实验人员会把 IP 后的上清分别进行诱饵蛋白 X 和靶蛋白 Y 的 WB 检测,该对照组称为 output 组。
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好了,说了这么多,希望本篇对大家有所帮助,祝伙伴们拿到心仪的实验结果。
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