细胞死亡的相关研究一直是生命科学领域的热点。依据发生机制的不同 (起始的刺激、中间过程的激活和末端的效应器的不同) ，细胞的死亡可以区分为不同的方式，常见的有细胞凋亡、焦亡、坏死、铁死亡等。 

图 1. 不同死亡方式的比较

"铁死亡"的相关研究更是近几年热点中的“热点“，这也证明了金属元素在细胞死亡中的独特作用。迎来铁死亡，又遇铜死亡。

今年 3 月题为 Copper induced cell death by targeting lipoylated TCA cycle protein 一文提出：生物体内不可缺少的微量元素—铜在其浓度超过了维持稳态机制的阈值时也会表现出细胞毒性。这种现象与铁积累导致细胞死亡的情况有相似之处 (但机制明显区别于铁死亡)。研究人员将这种铜离子诱导细胞死亡的机制命名为 “铜死亡” (Cuproptosis)。

■ 铜死亡的简要机制

铜离子载体诱导的细胞死亡: 当 Cu²⁺ 在依赖线粒体呼吸的细胞中过度积累 (Cu²⁺ 通过铜离子载体运入细胞)，Cu²⁺ 与硫辛酰化 DLAT 结合，诱导 DLAT 的异聚化。不溶性 DLAT 的增加导致细胞毒性，诱导细胞死亡。

注：蛋白质硫辛酰化修饰是一种保守的赖氨酸翻译后修饰，只发生在涉及 TCA 循环的四种蛋白，其中就包括 DLAT。DLAT 是丙酮酸脱氢酶复合体 (PDH Complex) 组分之一，丙酮酸脱氢酶可催化 TCA 循环中的丙酮酸脱羧生成乙酰辅酶 A。

FDX1 (一种还原酶、Elesclomol 的直接靶标) 作为蛋白质硫辛酰化修饰的上游调节因子，一方面，参与调节蛋白质 (包括 DLAT) 的硫辛酰化。另一方面，FDX1 将 Cu²⁺ 还原成更具毒性的 Cu⁺，导致 Fe-S 簇蛋白合成的抑制，诱导细胞死亡。

铜稳态失调导致的细胞死亡: 铜的稳态主要依赖与三个铜转运蛋白 SLC31A1、ATP7A/B、SLC31A1，SLC31A1 负责摄入铜，ATP7A 和 ATP7B 负责转出铜。铜稳态失调导致的细胞死亡与铜离子载体诱导的细胞死亡的机制一致。

图 2. 铜死亡机制图^[1]

■ 铜离子载体诱导的细胞死亡

在这篇文章中，研究人员测试了 1448 个铜离子载体 (一种高度亲脂性的 Cu²⁺ 结合分子，可将铜离子送入细胞)，发现对 489 个细胞系的细胞杀伤作用 (图 3A)。以 Elesclomol (一种高度亲脂性的 Cu²⁺ 载体) 为例，单独加入 Elesclomol 不影响细胞的生长，同时加入铜离子，细胞生长就会受到极大抑制，而其他金属离子 (铁、钴、锌和镍等) 并不会影响细胞的生长 (图 3B)。使用 NSC-319726，Disulfiram 等其它铜离子载体处理细胞也得到了相同的结果 (图 3D-E)。

但使用 Tetrathiomolybdate (TTM；一种铜螯合剂) 联合 Elesclomol 处理细胞，可以缓解 Elesclomol 对细胞的杀伤作用。这些结果表明铜离子载体诱导的细胞死亡主要依赖于细胞内铜的积累。 

图 3. 铜离子载体诱导的细胞死亡对铜具有高度选择性^[2]

A：1448 个铜离子载体对 489 个细胞系的生长抑制；B：不同金属离子的情况下，用 Elesclomol 处理 MON 细胞；C：其他铜离子载体条件的细胞活力测定 D：使用 TTM 预处理 ABC1 细胞，然后 Elesclomol 处理

 
■ 铜离子载体诱导细胞死亡是非凋亡性的

有研究表明 Elesclomol 诱导活性氧依赖性细胞凋亡，但实验结果表明 Elesclomol 诱导的细胞死亡不涉及 Caspase 3 (细胞凋亡的标志) 的切割或激活 (图 4D-E)。并且当细胞凋亡的关键效应子 BAX 和 BAK1 被敲除时，以及用 Caspase 抑制剂 (Z-VAD-FMK 和 Boc-D-FMK) 处理细胞，Elesclomol 仍然维持对细胞的杀伤潜力，此外，其他已知细胞死亡机制的抑制剂处理细胞 (包括铁死亡 (Ferrostatin-1)、坏死性凋亡 (Necrostatin-1) 和氧化应激 (N-acetylcysteine) )，也都未能消除铜离子载体诱导的细胞死亡。

这些结果表明铜离子载体诱导的细胞死亡机制与细胞凋亡途径不同。

图 4. 铜离子载体诱导细胞死亡不通过凋亡^[2]

A：ICP-MS 检测细胞内的铜离子和锌离子；B：ES-Cu 处理 细胞，检测 Caspase 3/7 的激活；C：检测 Caspase 3 的表达；F：用 Elesclomol-CuCl₂ 处理 KO 细胞，检测细胞活力；

 
■ 线粒体呼吸调节铜离子诱导细胞死亡
研究人员观察到主要依赖线粒体呼吸的细胞对铜离子的敏感性更高 (图 5A)。用线粒体抗氧化剂、脂肪酸和线粒体功能抑制剂等线粒体呼吸途径相关的抑制剂处理细胞，发现：电子传递链复合物的抑制剂和线粒体丙酮酸摄取抑制剂 (UK5099) 处理的条件下，铜离子诱导的细胞死亡受抑制，铁死亡抑制剂的处理对其没有影响 (GPX4 抑制剂 ML162) (图 5B)。
 
此外，线粒体氧化磷酸化解偶联剂 FCCP 处理对铜离子诱导的细胞死亡没有影响。这些结果表明线粒体呼吸途径是铜离子载体诱导细胞死亡的必要条件。
 
研究人员还对比了缺氧条件刺激以及 FG-4592 激活缺氧诱导因子 (HIF) 途径，发现只有真实缺氧条件会降低细胞对铜离子载体的敏感性 (图 5D)，进一步确认了线粒体呼吸在铜诱导细胞死亡中的关键作用。
 
随后，研究人员分析铜离子处理对细胞耗氧率 (OCR) 的影响，结果显示 Elesclomol 的处理会影响细胞的最大耗氧量 (图 5E)。这表明铜离子可能不直接影响电子传递链，而是影响三羧酸循环 (TCA)。

图 5. 线粒体呼吸调节铜细胞诱导细胞死亡^[2]
A-B：葡萄糖或半乳糖的条件下，检测细胞活力；B：Elesclomol 等处理细胞，检测细胞活力；C：FCCP 预处理细胞后用 Elesclomol 处理，检测细胞活力；D：对照组 (21% O₂)、缺氧的条件 (1% O₂) 或 FG-4592 (21% O₂) 条件下检测细胞活力；E：细胞耗氧率检测

 
■ FDX1 和蛋白硫辛酰化是铜细胞诱导细胞死亡的关键调节者

为进一步阐明铜离子和 TCA 循环之间的联系。研究人员使用 CRISPR-Cas9 技术，分别敲除不同的基因，再使用铜离子载体 (Elesclomol-copper) 处理细胞，以确定涉及参与铜离子载体诱导细胞死亡的基因。

结果发现有 7 个基因的敲除可以明显缓解铜离子载体介导的细胞杀伤作用 (图 6A-C)，包括 FDX1，LIPT1、LIAS、DLD (硫辛酸途径的三个关键酶)，DLAT、PDHA1、PDHB (丙酮酸脱氢酶复合体的三个组分)。另外，敲除 FDX1 和 LIAS 基因明显减轻铜离子载体引起的细胞毒性(图 6D-E)，研究人员猜测 FDX1 有可能是蛋白质硫辛酰化修饰的上游调节因子。

图 6. FDX1 和硫辛酸途径相关基因是铜离子载体诱导细胞死亡的关键介质^[2]
A：敲除了不同基因后，细胞参与铜离子载体诱导的死亡的基因 B：硫辛酸通路的示意图；C-E：敲除 ABC1 细胞的 FDX1 和 LIAS 基因，用 Elesclomol 处理细胞，检测细胞活力。

为进一步验证这个假设，研究人员通过资源库 Cancer Dependency Map，发现 FDX1 和硫辛酸途径相关蛋白在铜离子载体诱导细胞死亡方面是高度相关的 (图 7A)。随后，研究人员选取肿瘤样本，对 FDX1 和硫辛酰化蛋白进行免疫组化染色，发现 FDX1 和硫辛酰化蛋白表达显著相关 (图 7B-C)。敲除 FDX1 会导致 DLAT 蛋白和 DLST 蛋白的硫辛酰化缺失 (图 7D)，还会导致细胞呼吸水平下降 (图 7E)。

此外，研究人员通过代谢物分析发现敲除 FDX1 会导致丙酮酸和 α-酮戊二酸积累和琥珀酸的的消耗。还观察到 LIAS 的关键底物 S-腺苷甲硫氨酸 (SAM) 的积累。这些结果表明 FDX1 是蛋白质硫辛酰化的上游调节剂 (图 7F)。

图 7. FDX1 是蛋白质硫辛酰化的上游调节器^[2]
A：FDX1 敲除的相关基因网络；B-C：肿瘤样本的 FDX1 和硫辛酸的免疫组化染色；D：敲除 FDX1，检测硫辛酰化蛋白的表达量；E：敲除 FDX1 基因，检测细胞耗氧率；F：敲除 FDX1，检测与硫辛酰化途径相关的代谢物的变化。

 
■ 铜直接结合并诱导硫辛酰化 DLAT 的寡聚化
有研究报道铜离子与游离脂酸的离解常数为 10^–17，这表明铜离子有可能直接与硫辛酰化蛋白结合。为了验证这一猜想，研究人员纯化了 DLAT 和 DLST 蛋白，发现 DLAT 和 DLST 都可以与偶联铜的树脂结合 (图 8A)。而敲除 FDX1 会导致 DLAT 蛋白的硫辛酰化修饰消失，且 DLAT 和 DLST 也不再与偶联铜的树脂结合 (图 8B)。这表明蛋白质的硫辛酰化修饰是结合铜的必要条件。此外，铜与硫辛酰化蛋白 DLAT 的结合，会导致蛋白的寡聚化。而 Elesclomol 处理会增加 DLAT 蛋白的寡聚化 (图 8C-D)。
上述结果表明：在铜离子载体处理后硫辛酰化蛋白的毒性是由它们异常的寡聚作用介导的。此外质谱分析还发现铜离子载体处理会导致 Fe-S 簇蛋白的水平降低 (图 8E)，这整个过程都依赖于 FDX1 蛋白的存在。

图 8. 铜直接结合硫辛酰化的 DLAT 并诱导其寡聚化^[2]
A：细胞提取蛋白和偶联铜的树脂的结合；B：FDX1 敲除细胞中提取蛋白和偶联铜的树脂的结合；C：IB 分析 DLAT 蛋白寡聚化；D: 免疫荧光共定位分析 E: Mass 分析

■ 铜诱导细胞死亡机制与铜稳态失调的遗传模型相同
铜的稳态主要依赖与三个铜转运蛋白 (图 9A)。为了进一步验证与铜离子载体介导的死亡与自然状态下的铜紊乱的机制是否相同，研究人员过表达 SLC31A1(图 9B)。另外，过表达 SLC31A1 的细胞被铜离子载体处理后蛋白硫辛酰化减少，Fe-S 簇蛋白水平降低，HSP70 水平升高 (图 9C)。
 
在过表达 SLC31A1 的细胞中使用铁死亡、坏死性凋亡和凋亡抑制剂不影响铜诱导的细胞死亡，铜螯合剂却可缓解铜离子载体产生的细胞杀伤作用 (图 9D)。老年 ATP7B 缺陷小鼠 (Atpb7b^−/−，铜失调综合征 Wilson’s disease 模型) 与杂合子 (Atpb7b^+/−) 和野生型对照小鼠对比，发现 ATP7B 缺陷小鼠的肝脏中蛋白的硫辛酰化水平和 Fe-S 簇蛋白的含量均有显著降低，Hsp70 蛋白则有明显增加 (图 9F)。多种模型证明铜稳态失调导致的细胞死亡和铜离子载体诱导的细胞死亡是同一种机制。

图 9. 化学和基因诱导的铜依赖的细胞死亡之间具有共同的机制性^[2
A：铜稳态示意图；B-C：过表达SLC31A1，CuCl₂ 处理细胞；D：用  Nec-1 等处理过表达 SLC31A1 的细胞，加入 CuCl₂，检测细胞活力；E：FDX1 KO 细胞中过表达 SLC31A1，加入 CuCl₂ 处理后检测细胞的活力；F：检测 Atpb7b^-/- 小鼠与对照组肝脏的蛋白质含量

总结：
 
这项研究通过利用多种死亡方式的诱导剂与抑制剂从多维度阐明了铜离子诱导的细胞死亡是一种新型细胞死亡即铜死亡。研究人员发现铜离子积累主要通过调控 FDX1 来介导铜死亡。
 
一方面，FDX1 将 Cu²⁺ 还原成更具毒性的 Cu⁺，可促使 TCA 循环中硫辛酰化蛋白异常寡聚化，另一方面，FDX1 导致 Fe-S 簇蛋白的不稳定。

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参考文献

1. Yongqiang Wang, Long Zhang, Fangfang Zhou. Cuproptosis: a new form of programmed cell death. Cell Mol Immunol. 2022 Apr 22.

2. Tsvetkov P, Coy S, Petrova B, et al. Copper induces cell death by targeting lipoylated TCA cycle proteins. Science. 2022;375(6586):1254-1261.

3. Li SR, Bu LL, Cai L. Cuproptosis: lipoylated TCA cycle proteins-mediated novel cell death pathway. Signal Transduct Target Ther. 2022;7(1):158.

4. Tang D, Chen X, Kroemer G. Cuproptosis: a copper-triggered modality of mitochondrial cell death. Cell Res. 2022;32(5):417-418.