肿瘤的生长需要大量能量供给，为满足其对能量的高需求，肿瘤细胞重编程其新陈代谢，维持他们的生存所需^[1]。营养充足的条件下，细胞喜欢输入胞内游离氨基酸来满足其营养需求，但也有许多很存在于细胞外坏境中的氨基酸 (细胞外空间的蛋白质)，在饥饿或营养不良等严峻生存条件下，癌细胞以这些细胞外蛋白质为“食”，以便艰苦条件下的茁壮成长。

细胞内营养物质的运输是一个高度动态和精细调控的过程^[2]，癌细胞究竟是怎样利用细胞外蛋白质作为营养物质的呢？关键的因子和途径有哪些？ 

Science 背靠背，发现 LYSET 

当癌细胞处于营养缺乏的环境时，营养物质大多通过一种称为巨胞饮作用 (macropinocytosis) 的机制来获取。所谓巨胞饮，指细胞在被营养因子等刺激后，细胞膜皱缩并包裹大量外营养物质，再运送到溶酶体 (细胞中至关重要的的降解区室) 中降解。溶酶体将蛋白质分解成氨基酸, 通过产生细胞内营养源以维持饥饿条件下间细胞功能。  今年 Science 杂志背靠背发表了关于溶酶体转运因子 (LYSET) 生物功能的研究性论文的研究性论文^[3,4]，RICHARDS 团队等人利用 CRISPR 遗传筛选技术鉴定出一种膜蛋白 LYSET，研究表明 LYSET 对溶酶体酶的运输至关重要，没有 LYSET，靶向溶酶体的运输被严重破坏^[3]。

图 1. Science 背靠背 

LYSET 对溶酶体生物发生至关重要 

有必要在这里先讲一下溶酶体生物发生，它是 M6P 依赖的靶向途径，需要溶酶体蛋白质的合成和核内体-溶酶体运输的协调。包括溶酶体酶的合成，高尔基体转运，以及识别和转运三部曲 (图 2)。 

图 2. 溶酶体水解酶 m6p 依赖靶向途径^[4]

(1) 溶酶体酶的合成：溶酶体酶在内质网中合成，在那里它们获得 N-连接的14-糖高甘露聚糖，经过低聚糖连接和修饰，运输到高尔基体 (cis-Golgi)。 

(2) 高尔基体转运：N-糖基化溶酶体酶寡糖链上的甘露糖残基被磷酸化，经历一系列酶促反应，导致甘露糖-6-磷酸 (Mannose-6-phosphate) M6P 基团的加入，会形成 M6P 标志。

(3) 识别和转运：高尔基体 (trans 面) 某些区域分布着 M6P 受体 (M6P Receptor)，识别 M6P 标志，具有 M6P 修饰的溶酶体酶被 MPR 识别并最后以出芽的方式形成网格蛋白/AP 包被小泡转运到核内体 (Endosome) 中。

敲黑板请注意! 高尔基体转运过程中，M6P 修饰的形成是溶酶体生物发生的重要标志。M6P 基团的加入，第一步由 GlcNac-1-磷酸转移酶 (GNPT；GlcNAc-1) 完成，第二步由 M6P 揭示酶 (UCE) 完成。GlcNAc-1 的稳定性依赖于 LYSET，没有 LYSET, GlcNAc-1 跨膜结构域不稳定，M6P 修饰不能形成，酶向溶酶体的运输道路被严重破坏, 溶酶体酶会被错误地转移到细胞表面。

 以上为溶酶体功能发生的具体过程，那么这一过程究竟是如何被癌细胞利用，作者的研究具体如何进行？下面的故事将围绕 LYSET 和 GlcNAc-1 展开。 

■ CRISPR 筛选识别 LYSET

为确定细胞外蛋白质产生营养的细胞途径 (前面提到有 2 种途径，胞饮作用和溶酶体分解代谢来摄取营养物质，或直接摄取单体氨基酸)，作者团队首先选择了MIA PaCa-2 细胞作为初步筛选模型 (该细胞来源于胰腺癌；是一种营养缺乏的肿瘤类型)，实验过程中，必需氨基酸亮氨酸 (Leu) 单体形式提供或包含在白蛋白(albumin) ( 3-4 %为生理水平，图 3a 左), 当 Leu 缺乏，MIA PaCa-2 通过溶酶体白蛋白分解代谢在缺乏 Leu 的培养基中维持增殖 (图 3b)，即以细胞外蛋白为食, 这个过程中有一个选择性命中的突出蛋白是跨膜蛋白 LYSET (图 3c)。

为了验证这种选择性依赖性，研究者构建了 LYSET-KO MIA PaCa-2 细胞 (图 3d)。在添加 3% 白蛋白但缺乏亮氨酸的培养基中，LYSET 的缺失强烈抑制了所有癌细胞系的增殖和活力 (图 3e)。在体实验中，LYSET 缺陷的癌细胞基本无法在小鼠皮下形成肿瘤 (图 3f)。 

以上结果表明，在营养丰富的条件下，LYSET 对于癌细胞的生长可有可无，但当细胞外蛋白质是必需的营养物质时，体外氨基酸匮乏的条件下，LYSET 是选择性需要的，为进一步确定其功能，作者团队探索了 LYSET 在胞饮作用、单体摄入和溶酶体分解代谢中的可能作用。

图 3. CRISPR 筛选确定 LYSET 在癌细胞使用细胞外蛋白质作为营养物质时具有选择性

■ LYSET 是溶酶体降解 Cargos 所必需的必要因子

在 LYSET 缺失的情况下，白蛋白摄取过程和内体货运输到溶酶体没有改变 (图 4a 和 b；荧光标记 Albumin 检测白蛋白的摄取和 Dex1/2 追踪内吞 Cargos 到溶酶体的转运)，但是由于溶酶体分解代谢显著降低，荧光标记牛血清白蛋白猝灭 (degradation BSA; DQ BSA) (图 4c，绿色荧光标记的减少)。

图 4. LYSET 是通过溶酶体分解代谢产生营养物质所必需的

溶酶体分解代谢是两种代谢途径的汇合点-胞饮和自噬 (分别可提供胞外和胞内成分)。LYSET 的缺失会导致自噬体蛋白 p62 和 LC3-II 的强烈积累 (图5a)，溶酶体通过各种酶分解生物分子，而在缺乏 LYSET 的细胞中，许多溶酶体酶的活性降低 (图5b)。以上结果表明，LYSET 是通过溶酶体分解代谢产生营养物质所必需的，它可能会影响溶酶体酶活性，使溶酶体降解货物的能力受损。

图 5. LYSET 是大胞细胞和自噬细胞的溶酶体分解代谢所必需的

■ LYSET 缺陷的细胞中，溶酶体酶的最终命运如何？

研究者进一步测定 MIA PaCa-2 细胞的 LYSET KO 蛋白质组的变化 (LFQ)。 LYSET 缺陷细胞 <6% 的蛋白发生了显著变化，其中自噬货物受体是最富集的蛋白质之一 (图 5a), 细胞溶酶体酶和其他溶酶体腔蛋白的整体下降 (图 5b-c)，但是溶酶体膜蛋白丰度没有明显的变化 (图 5d)。作者团队还测定了细胞外空间的酶水平。在 LYSET 缺陷细胞的上清液中，组织蛋白酶的未成熟形态显著增加 (溶酶体管腔蛋白通常富集在细胞上清液中)(图 5e)。以上结果表明，在没有 LYSET 的情况下，大多数正常流向溶酶体腔的蛋白质被错误地输送到细胞外空间。 

图 5. LYSET 缺陷的细胞中，溶酶体酶的最终命运

■ LYSET 是甘露糖-6-磷酸途径的核心成分

前面已经给到大家介绍过：新合成的溶酶体酶在 N-链聚糖链上接受甘露糖-6-磷酸(M6P) 修饰过程中 (GlcNAc)-1-磷酸转移酶和 M6P 揭露酶 (UCE) 发挥作用 (图 6a)。

为检测 M6P 修饰在 LYSET 缺陷细胞中的状态，使用了一个单链抗体片段，专门检测含有 M6P 的蛋白质，LYSET 缺失会导致含有 M6P-modified 蛋白质的细胞数量大幅下降，这表明 LYSET 是 M6P 通路的一个组成部分。GNPTAB 编码 GlcNAc - 1-磷酸转移酶复合物的 a 和 b 亚基)，删除 LYSET 和 GNPTAB 的任何一个基因，都会引起了 M6P 修饰 (图 6b) 和成熟的溶酶体酶 (图 6b-d) 的减少，即使在以细胞外蛋白为营养物质的条件下，细胞增殖都会被抑制 (图 6e)。 以上表明 LYSET 是 M6P 途径中溶酶体酶运输的必要和特定成分。  

图 6. LYSET 是甘露糖-6-磷酸途径的核心成分

总结

营养不良的条件下，细胞从环境中摄取的蛋白质会传递给溶酶体，溶酶体将蛋白质分解成组成蛋白质的氨基酸, 产生细胞内营养源，溶酶体可以在饥饿期间维持细胞功能。 这一过程通常被实体瘤的癌细胞利用 (如上述胰腺癌)，在这种严峻的生存条件下，癌细胞通常使用 LYSET/M6P 依赖的溶酶体蛋白质分解代谢来获取氨基酸作为营养物质。并且这种途径是选择性的，在营养充足的条件下不损害细胞活力和生长。  

参考文献

1.Vincent El Ghouzzi, Gaelle Boncompain. Golgipathies reveal the critical role of the sorting machinery in brain and skeletal development. Nat Commun. 2022 Dec 1;13(1):7397.  

2.Hua Li, Wang-Sik Lee, et al. Structure of the human GlcNAc-1-phosphotransferase αβ subunits reveals regulatory mechanism for lysosomal enzyme glycan phosphorylation. Nat Struct Mol Biol. 2022 Apr;29(4):348-356.  

3.Catarina Pechincha, Sven Groessl, Robert Kalis, et al. Lysosomal enzyme trafficking factor LYSET enables nutritional usage of extracellular proteins. Science.2022 Oct 7;378(6615):eabn5637.  

4. Christopher M Richards , Sabrina Jabs, Wenjie Qiao, et al. The human disease gene LYSET is essential for lysosomal enzyme transport and viral infection. Science.2022 Oct 7;378(6615):eabn5648