本文介绍的是西安电子科技大学生命科学技术学院西安市跨尺度生命信息智能感知与调控重点实验室陈雪利教授课题组对“基于超连续谱光纤激光器的相干反斯托克斯拉曼散射显微术用于无标记化学成像”的研究工作，发表在《Journal of Innovative Optical Health Sciences》期刊2022年第4期。

Supercontinuum fiber laser-based coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy for label-free chemical imaging

基于超连续谱光纤激光器的相干反斯托克斯拉曼散射显微术用于无标记化学成像

NanWang, Jiaojiao Zhang, Wangting Zhou, Siting Liu, Jing Li, Xinyi Xu, Qi Zeng, Yong Li, Shouping Zhu and Xueli Chen

研究背景

相干反斯托克斯拉曼散射(Coherent anti-Stokes Raman Scattering, CARS)显微镜可以以无标记方式实现生物样本化学组分及其分布的检测，已在多个领域获得了广泛应用。当前，CARS显微成像技术多采用固体激光器激发样本信号；这种激光器一般较为笨重，价格昂贵且对环境变化比较敏感。近年来，超连续谱光纤激光器由于其超宽且稳定的光谱，设计紧凑、使用灵活方便等特点，在生物医学领域中的应用越来越广泛。已有基于超连续谱光纤激光器的CARS成像技术存在一些问题，例如系统仅能检测样本的拉曼光谱、成像速度比较慢、成像视野小等。

内容简介

本文自主搭建了一套基于超连续谱光纤（Supercontinuum fiber, SF）激光器的低成本CARS显微成像系统（ScCARS），其中泵浦光源采用可调谐脉冲激光器（400-2400nm），斯托克斯光源采用1064nm种子源。通过对光源进行调制实现时间及空间的同步，进而照射样本激发CARS信号。为了验证系统的可行性，本文采用二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide, DMSO）为样本，分别检测不同样本浓度下样本的特征波段CARS信号，计算得到系统的空间分辨率为445nm，灵敏度为70.5mM。进一步，通过对不同粒径以及不同种类的微球进行成像，验证了其在多色成像方面的能力。最后，本文对不同的癌细胞以及角膜基质透镜中的脂类成分进行检测，探索了系统在生物应用方面的潜力。

图文导读

1.基于超连续谱光纤激光器的CARS成像系统

图1：自主搭建的ScCARS成像系统。（a）ScCARS系统示意图。（b）ScCARS系统实物图

基于超连续谱光纤激光器的CARS成像系统如图1所示，激发光源采用双通道同步输出的脉冲激光器，其中通道一选择400-2400nm可调谐脉冲激光器输出泵浦光，通道二配备1064nm脉冲激光作为斯托克斯光。两束激发光源通过光束质量优化后经延时装置以及二向色镜实现时间及空间的同步；同步光源继而通过扫描模块照射样本。样本激发产生的CARS信号经物镜收集后，经带通滤光片滤除杂散光干扰后被PMT收集，获得样本不同波数下的CARS图像用于后续分析。

2.ScCARS系统性能

图2：ScCARS系统性能表征。（a-b）分别为DMSO样本的CARS信号与斯托克斯光功率以及泵浦光功率的响应曲线。（c）DMSO样本在2931cm-1的CARS图像，红线用于拟合计算系统空间分辨率。（d）系统空间分辨率拟合曲线。（e）不同浓度的DMSO样本图像的信噪比拟合曲线。（f）DMSO样本浓度为141mM时的CARS图像。比例尺为10μm

图2（a）与2（b）验证了不同激发光功率对于样本CARS信号的影响。由图可知，随着斯托克斯光源激发功率的增加，CARS信号强度线性增强（2（a））；当泵浦光源功率增加时，CARS信号呈现平方变化关系；该拟合结果与CARS信号产生理论相吻合。图2（c）为DMSO样本在特征波数2931cm-1处的信号图像。为进一步计算系统的空间分辨率，本文绘制了样本在成像区域（2（c）红线所示）的响应曲线，如图2（d）所示，空间分辨率可达445nm。系统灵敏度的检测则通过对不同浓度DMSO样本的CARS信号进行拟合获得，由图2（e）可知，当DMSO样本浓度减小为70.5mM时，信噪比依然大于1，由此推断系统灵敏度优于70.5mM。图2（f）为DMSO样本在141mM时的CARS图像。

3.微球多色成像实验

图3：聚苯乙烯微球以及聚甲基丙烯酸甲酯微球的ScCARS成像。（a-b）聚苯乙烯微球（a）以及聚甲基丙烯酸甲酯微球（b）分别在在特征波数2871cm-1、2931cm-1，以及非特征波段3259cm-1处的CARS图像。（c）两种微球的双色混合成像。比例尺为10μm

图3为不同粒径的聚苯乙烯微球（a）以及聚甲基丙烯酸甲酯微球（b）在共振区以及非共振区域的CARS图像。由图可知，ScCARS系统可以有效检测样本的信号；进一步，利用该系统对两种微球进行双色成像，如图3（c）所示，由此证明了scCARS显微成像系统在分辨样品不同组分方面的有效性。

4.不同癌细胞以及角膜基质透镜的成像实验

图4：不同癌细胞以及角膜基质透镜CARS成像。（a-b）食管癌细胞（a）以及乳腺癌细胞（b）在特征波段2931cm-1以及非特征波段3101cm-1处的CARS图像。（c）黑色素瘤癌细胞在2910cm-1以及2577 cm-1的CARS图像。（d）角膜基质透镜在2940cm-1以及3400cm-1处的CARS图像。比例尺为30μm

本文进一步利用ScCARS显微成像系统对不同癌细胞的脂滴分布以及角膜基质透镜的相关成分信息进行了检测。图4为不同癌细胞样本（图4（a）-4（c））以及角膜基质透镜样本（4（d））分别在共振区域以及非共振区域的CARS图像。这些成像结果进一步验证了scCARS显微镜在识别不同生物样本分子组分（脂质、蛋白质等）方面的潜力。

通讯作者简介

陈雪利，西安电子科技大学生命科学技术学院“华山学者”特聘教授、博士生导师，生物医学工程学科方向负责人、生物医学光子学与分子影像研究室负责人，西安市跨尺度生命信息智能感知与调控重点实验室主任，入选了国家级青年人才、陕西省杰青、陕西省“特支计划”青年拔尖人才、陕西省青年科技新星等，兼任陕西省生物医学工程学会理事、中国光学学会生物医学光子学专委会委员、中国图学学会医学影像与设备专委会委员、中国医药生物技术协会造影技术分会委员、光子学报首届青年编委等。长期从事生物医学光子学与分子影像新技术及其应用研究，主持国家重点研发计划课题、国科金重大科研仪器研制项目子课题、国科金面上项目、霍英东青年教师基金、陕西省杰青等项目10余项。近五年以第一或通讯作者在Nat. Commun.等发表SCI论文30余篇，英文专著章节2篇；授权美国专利2项，中国发明专利10余项，应用转化4项；以第一完成人荣获陕西省自然科学二等奖和陕西高校科学技术一等奖。