滚环转录：一种生产 RNA 微球的新系统，用于提高农业上重要的鳞翅目害虫的 RNAi 效率

     研发了一种新的RNA干扰（RNAi）系统，该系统采用滚环转录（RCT）技术来生成RNA微球（RMS），用于靶向两个关键的几丁质合成途径基因[几丁质合酶A（CHSA）、几丁质合酶B（CHSB）] 东方粘虫 (Mythimna split) 的幼虫，一种对 RNAi 不敏感的农业上重要的鳞翅目害虫（图 1）。

图 1. 合成单链 DNA (ssDNA) 模板的构建以及滚环转录 (RCT) 的机制，以产生用于 M. 分离的 RNAi 实验的 RNA 微球 (RMS)

用经 RMS-CHSA 或 RMS-CHSB 处理的玉米叶盘喂养三龄幼虫，在 72 小时时分别抑制 CHSA 81.7% 或 CHSB 88.1%。CHSA 的沉默影响了幼虫的发育，包括第 7 天的体重（54.0％）和长度（41.3％）的减少，并导致第 14 天幼虫死亡率（51.1％）。用 RMS-CHSB 喂养的幼虫也获得了类似的结果（图 2）。 

图 2. RNAi 后的体长和体重

还比较了不同策略之间的 RNAi 效率：1）两种多目标 RMS [即 RMS-(CHSA+CHSB)、RMS-CHSA+RMS-CHSB]，以及 2）多目标 RMS 和单目标 RMS（即 RMS），RMS-CHSA 或 RMS-CHSB），发现 RNAi 效率没有显著差异。通过使用Cy3标记的RMS，我们证实RMS可以快速内化到Sf9细胞中（<6小时）（图 3）。

图 3. Sf9细胞与Cy3标记的RMS-EGFP(500ng)孵育6小时后细胞对RNA微球(RMS)的摄取

细胞对 RMS 的快速摄取以及通过幼虫摄食的 RNAi 效率表明，基于 RCT 的 RNAi 系统可以很容易地应用于研究基因功能，并进一步开发为用于害虫管理的生物农药。

此外，我们的新 RNAi 系统利用了 microRNA (miRNA) 介导的 RNAi 途径，使用目标昆虫从 RMS 体内产生的 miRNA 双链体。该系统可用于多种昆虫物种的 RNAi，包括鳞翅目昆虫，使用其他 RNAi 方法时，这些昆虫通常表现出极低的 RNAi 效率。

https://doi.org/10.1016/j.pestbp.2023.105680

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