基于RNAi的库蠓防治策略研究进展

库蠓是一种小型叮咬蠓，具有在世界大部分地区传播重要牲畜病原体的能力，它们对动物福利的影响可能会扩大。例如，库蠓媒介病毒引起的出血性疾病可给生产者造成数百万美元的经济损失。化学杀虫剂可以减少库蠓的丰度，但可能不足以抑制种群数量以防止病原体传播。这些杀虫剂还可能对非目标生物和生态系统造成负面影响。RNA干扰(RNAi)是一种降解mRNA并抑制基因表达的细胞调控机制。研究已经检查了这种机制在害虫控制中的效用，并通过它描述了生产、优化和应用这些基于RNA的产品的障碍。与化学杀虫剂相比，这些方法具有高度的特异性和环境友好性，并且比转基因昆虫更短暂。鉴于库蠓缺乏可用的控制方法，基于RNAi的产品可能是一种以最小的环境影响治疗大面积库蠓的选择。在本研究中，我们描述了目前库蠓控制方法的现状，利用RNAi进行害虫控制的成功和障碍，以及将基于RNAi的库蠓控制方法实现所需的必要研究。

1. 介绍

家畜易感染由库蠓(双翅目:蠓科)传播的多种病毒、原生动物和线虫病原体[1]。畜群(如牛)中的疾病可以通过降低动物增重、减少产奶量和增加动物死亡率来影响牲畜生产者[2]。这些昆虫分布在世界大部分地区，气候变化的影响可能会加剧库蠓构成的风险[3,4,5,6,7]。气温升高预计会增加季节性蠓的活动，缩短越冬期，甚至增强昆虫体内的病毒复制[8,9]。需要有效的控制策略来保护易感畜群免受库蠓传播疾病的侵害。

通过管理易感动物(例如，在咬蚊活动增加的时段将动物饲养)和其他培养控制方法有助于减少病原体传播[10]。病媒控制是减少库蠓负担所需的多因素方法的另一个方面，其最终目标是减少疾病媒介传播[11]。然而，很少有产品被标记为针对库蠓。对成年种群常用的化学杀虫剂包括拟除虫菊酯和有机磷[12]。这些非特异性产品在大规模应用中受到关注，甚至昆虫生长调节剂(IGRs)，它们对环境更特异性和更安全，可以影响非目标昆虫物种。微生物衍生的杀虫剂，如含有苏云金芽孢杆菌亚种的杀虫剂。由于其生物学性质和特异性，Bt毒素为更安全的产品[13]。报告显示，这些产品对蚊虫非常有效，但对蠓无效[14]。利用RNA干扰(RNA interference, RNAi)抑制库蠓基因表达的研究还很简单，但其作为一种幼虫控制策略的应用价值值得探索。我们总结了库蠓的影响和最近在管理其种群方面的进展。我们还强调了RNAi如何通过检查蚊子作为蠓的代理的研究来控制库蠓。最后，我们讨论了基于RNAi的库蠓杀虫剂的开发和评价方法。

2. 库蠓类

库蠓是一种小型食血蝇类，在世界大部分地区已发现超过1300种[1,15]。雌性吸血产卵可能会引起特别刺激的叮咬，因为它们会撕裂皮肤，并使用唾液蛋白的复杂混合物来减弱宿主的反应[16]。库蠓以多种宿主(哺乳动物、鸟类和爬行动物)为食，这取决于蠓的种类、地点和宿主的可用性[1]。只有少数库蠓有能力传播重要的家畜病原体，但它们的行为和生态可能各不相同，并使控制策略混乱[17]。

血液喂养的库蠓在最佳温度下几天内产卵，并将其产卵到潮湿的基质中。卵迅速孵化，未成熟的蠓在化蛹和成虫之前要经过4个幼虫期。产卵的基质偏好取决于物种。常见的基质类型包括具有水-土界面的富粪肥泥、堆肥材料和动物粪便 [17]。然而，许多幼虫的栖息地似乎是未被描述或隐蔽的[11,18]。

成蚊的季节性也取决于物种和地理位置。库蠓成虫丰度的常见生态驱动因素包括:温暖的春秋季、较高的降水、湿度、靠近水源以及靠近牛羊等宿主[19,20,21,22]。评估蠓的丰度主要是通过使用二氧化碳诱捕器、光诱器或这些方法的组合诱捕成虫来完成的[23]。最近的研究表明，光引诱剂诱捕方法可能低估了物种丰富度和感染流行率，这是流行病学研究中的重要考虑因素[24]。可以从可疑的栖息地(例如，富含粪便的废水泥浆)收集幼虫并直接取样，或者可以在这些基质中的出苗陷阱中取样成虫[23]。这些技术对于监测库蠓的存在和丰度以及蠓种群中的病原体流行情况以监测对牲畜的风险是必要的。

库蠓在全球大部分地区被认为是许多病原体的媒介。最令人担忧的是影响牲畜的病毒，包括BTV、EHDV、VSV、AHSV、AKV和SBV[1,17]。OROV是为数不多的库蠓传播病原体之一，可引起人类疾病。其他病原体包括LSDV、BEFV和Simbu血清群病毒，它们与牲畜有关[25,26]。大多数家畜相关疾病的临床表现包括发热、病变、水肿和跛行。疾病可导致易感动物死亡，如羊的BTV、白尾鹿的EHDV和马的AHSV[1]。除了牲畜损失之外，库蠓相关疾病的进一步考虑因素包括动物体重减轻、产奶量下降和胎儿流产。这些结果给畜牧生产者带来了巨大的经济成本。仅2007年，BTV-8在法国和荷兰的经济影响就超过14亿美元，全球影响估计超过30亿美元[27]。畜牧生产者正面临库蠓相关疾病的巨大压力，这就强调需要有效的种群管理方法。

最近的研究证实，模型显示温度与库蠓的季节性丰度之间存在很强的关联[19,28,29,30]。气候变暖可能导致某些库蠓物种的活动范围扩大，即使在温度对已建立的物种来说过于温暖的地区也是如此，而其他更能适应这些条件的物种可能会建立起来[9,31]。这些蠓将继续在动物福利方面发挥重要作用，有必要采取多种控制措施与这些害虫作斗争。

3.当前的控制策略

大多数蠓属有害害虫，少数蠓属家畜相关病原体。因此，目前用于控制蠓的大多数控制策略侧重于减少畜牧业系统中的蠓数量。目前的策略大致可分为培养控制、化学杀虫剂和微生物杀虫剂。这些在之前已经被广泛地回顾过[10,32,33,34]。在本研究中，我们将描述该领域的最新进展及其对库蠓控制状况的影响。

3.1. 文化控制

给动物接种疫苗可以减少病毒传播和疾病严重程度。灭活疫苗是有效的，但有些疫苗的生产成本可能很高，而改良的活病毒疫苗则存在与野生型病毒重新组合的风险[4,35]。在存在多种病毒血清型和疫苗接种缺乏适当覆盖率的地区，这一问题也很复杂。畜群管理可能在放大病毒传播方面发挥作用。印度的一项研究发现，在感染BTV时没有症状的水牛被放置作为易感羊群的缓冲物，却成为病毒的宿主并导致疾病暴发[36]。这一发现表明，有效的疫苗运动需要考虑当地的病毒宿主。最近另一项研究的作者讨论了不给畜群接种疫苗的考虑，因为BTV疫苗的成本过高，而且在畜群动物中失去了保护性免疫。

疾病和媒介建模等预测措施正越来越多地用于检查过去的疫情，以预测未来的疫情[38,39,40,41,42]。这些模型基于全球库蠓的基本收集工作，这些工作将当地生态与物种丰富度和分布以及天气模式如何影响蠓的丰度联系起来[21,43,44]。一项研究在中国高海拔地区以前被认为不适宜居住的地区发现了库蠓[45]。这些数据有助于在大型区域建模工作方面取得进展，这些工作可以以具有成本效益的方式影响畜群流动和疫苗接种运动。

改变景观对库蠓的管理可能会降低蠓的丰度。在牲畜饲养作业中，清除粪便和其他有机废物限制了幼虫的可居住发育场所。2014年的一项研究评估了从加利福尼亚奶牛场移除废水收集点的影响，并将索诺氏梭菌的丰度与对照点进行了比较[46]。然而，作者发现了相反的效果，从没有污水池的农场收集了更多的库蠓。这些发现表明索诺氏弧菌可能利用其他与农业有关的水源。有效地识别这些站点以潜在地清除或处理它们可能会减少这些溢出事件[47]。景观改变的另一个考虑因素是将家畜与携带病毒的野生动物分开，如家畜中的BTV和EHDV[48,49,50,51]。对蠓血餐的分析可以更好地告知牲畜生产者哪些野生动物靠近管理的畜群，并可以为采取措施减少他们与以这两种动物为食的蠓的接触提供信息。

对库蠓进行有效控制的最有问题的因素可能是鉴定其幼虫的栖息地。最近的一篇文章证实了这一点，其中Braverman等人[18]描述了在以色列同一地区用吸收式诱捕器收集了58种库蠓成虫，但仅从基质中收集了15种库蠓幼虫。他们的工作继续评估了多种类型的基质，从有机贫乏的沙质土壤到富含有机肥料的泥浆，再到农田植被口袋中的树洞和水池。作者在所有类型的基质中都发现了库蠓，不同的物种喜欢不同的环境。两篇文章通过现场和实验室联合实验评估了佛罗里达州蠓的产卵偏好，强调了了解重要媒介物种的幼虫发育地点选择的重要性[52,53]。Wong等人[54]发现南加州库蠓喜欢在农业废水池水线5厘米范围内的湿润土壤上产卵。作者建议改变池塘的水位，使前一天晚上新产卵的卵干燥。诸如此类的措施相对简单，可能有效地控制那些利用大水源作为幼虫栖息地的物种。需要更多的基础研究来确定隐蔽的繁殖栖息地，并将为幼虫控制措施提供信息。

3.2. 化学杀虫剂

传统上，控制库蠓最常用的方法是在动物和建筑物上使用杀虫剂和驱蚊剂，并在已知或疑似适合未成熟发育的栖息地使用杀幼虫剂[32]。杀虫剂的使用可能导致库蠓产生抗药性，就像对其他害虫一样[33]。虽然特异性杀虫剂抗性似乎不是迫在眉睫的威胁，但实验室研究表明，杀虫剂在库蠓物种之间和物种种群内的药效是不同的[10,12,32]。这一观察结果促使需要采取新的控制措施，包括化学杀虫剂以外的措施。

对宿主动物局部施用杀虫剂可为成蚊创造目标暴露源。然而，杀虫剂和驱蚊剂在雨水中很快被洗掉，如果不经常重新施用，它们在田间的平均环境条件下会自然降解[32]。在最近的一项研究中，使用伊维菌素和溴氰菊酯局部施用于牛的中线，作者发现从处理动物和对照动物身上收集的饲喂血液的雌性数量没有显著差异[55]。这组作者指出，这些蠓似乎暴露在致命水平的杀虫剂中。虽然这是一种潜在的成年控制途径，但这些方法最初并不能防止潜在感染的雌性叮咬。

有效控制蠓的数量可能需要采用多种方法。最近的一项研究使用溴氰菊酯控制成虫，使用英蚊胺和氟虫腈处理幼虫栖息地[56]。这项研究发现，与作为实验对照的未经处理的农场相比，使用所有三种杀虫剂的绵羊农场的库蠓数量减少。选择幼虫处理区是根据其湿润生境和有机质组成。虽然这种方法是成功的，但当有关物种的繁殖栖息地未知时，这种方法可能并不总是可行的。

精油被认为是驱避或杀死库蠓成虫的一种更天然的替代方法，但其功效好坏参半[57]。Benelli及其同事[33]使用一种廉价的楝树产品来处理畜禽粪便径流池。与对照相比，这种处理成功地阻止了成虫在泥基质上产卵。研究人员将成虫的出现作为衡量标准，但没有对处理区域周围的幼虫数量进行量化。人们注意到，所使用的印楝素所生产的浓缩活性成分，即印楝素更便宜。该产品的成人驱避距离尚不清楚，因此不清楚需要处理的面积和频率。目前还没有一种化学杀虫剂或驱避剂能有效地防治库蠓。只要密切监测杀虫剂抗性和水生生态系统健康，管理成虫和幼虫阶段的联合方法将是最有效的[58]。

在半水生生态系统中处理库蠓幼虫阶段由于稀释效应、疏水化合物与水混合不良以及环境退化而变得复杂。此外，蠓很少独自占据这些栖息地，化学杀虫剂对非目标生物的影响是一个重要的考虑因素。研究发现，新烟碱类和氟虫腈等杀虫剂降低了农业作业附近生境中微观和宏观无脊椎动物的丰度[59]。处理3个多月后，土壤样品中检测到氯氰菊酯，许多营养水平受到负面影响[60]。半自然实验评估了氯菊酯在不同营养水平水生动物容器中的毒性[61]。水生昆虫对杀虫剂高度敏感，但需要注意的是，这些系统是停滞的，杀虫剂的使用水平高于推荐的处理率。化学杀虫剂对脱靶环境的影响不仅与农业生产者有关，而且与可能不知道杀虫剂对非靶物种的毒性的家庭消费者有关。

3.3. 微生物杀虫剂

昆虫病原真菌和细菌衍生的杀虫剂作为传统化学杀虫剂的生物理性替代品，在蚊虫控制中被广泛使用。在最近的一项研究中，昆虫病原真菌似乎可以杀死库蠓，而对那些非害虫昆虫没有脱靶效应[62]。应仔细考虑将真菌孢子大规模分布到环境中，但在牲畜饲养单位中使用可能是接触后感染蠓的有效策略。虽然这种情况不能防止叮咬，但它可以控制成年种群并在蠓产卵之前杀死它们，因为在24小时内观察到死亡率。

也许最著名的是那些含有来自Bti的杀虫毒素的产品，这些毒素对蚊子和黑蝇等双翅目昆虫有毒[13]。在蚊虫控制的大规模应用和许多类型的消费产品中，使用Bti是相当普遍的。然而，微生物Bti和商业配方的Bti作为杀蚊幼虫剂的功效有限。最近的一项研究确定了在撒丁岛收集的库蠓幼虫中Bti的致死浓度，发现该浓度远高于大多数蚊子种类[14]。这组作者表明，与从球形芽孢杆菌和后孢芽孢杆菌中提取的另外两种杀虫剂相比，Bti似乎效果最好。在一项早期研究中，两种北美蠓，一种库蠓和一种细蠓也未受到Bti产品的影响[63]。蠓对Bti毒性的耐受性与酸性肠道环境有关，而酸性肠道环境不允许毒素激活[64]。Bti杀虫剂的替代配方可以改变幼虫肠道pH值，但目前的Bti产品似乎不利于库蠓的控制。生物防治剂对环境的影响预计小于传统化学杀虫剂，但其风险不可忽视，应纳入任何风险评估。

4. 昆虫控制的RNAi

RNA干扰(RNAi)是一种保守的、高度特异性的抑制靶基因的机制。在害虫防治中，RNAi通过抑制生理上重要的蛋白质和酶而导致死亡或其他有利的结果。基于RNA的杀虫剂利用与害虫靶基因基因序列互补的核酸(如双链RNA和dsRNA)来抑制靶转录物水平。因此，效果应该对目标昆虫具有高度特异性，并且基于RNA的治疗应该是环境不稳定的。然而，尽管前景光明，在开发有效的基于RNAi的昆虫治疗方案方面仍有许多障碍需要克服。

4.1. 机制与作用

术语RNAi包含多个重叠的途径，其中RNA分子被降解。Zhu和Palli[65]回顾了主要途径，并在此进行简要讨论。小干扰RNA (siRNA)途径始于dsRNA与辅助蛋白R2D2或Loquacious结合，并被Dicer-2 (Dcr2)酶切。这些分裂产生大约22 bp的小的dsRNA产物，被称为siRNA分子。每个siRNA分子都被结合到包括Ago2酶在内的辅助蛋白复合体中。一条被称为“客链”的RNA链被降解，而剩余的RNA链则作为结合互补mRNA分子的向导。这种蛋白质和RNA的复合物被称为RNA诱导沉默复合物(RISC)。siRNA途径可以使用外源性或内源性dsRNA作为起始底物，并具有切割宿主mRNA以沉默基因表达、切割病毒RNA产物和沉默转座子的作用(图1)。

还有另外两种途径在功能上与siRNA途径重叠，其终点是RNA的降解。microRNA (miRNA)途径通过宿主源性RNA模板导致宿主基因沉默。miRNA途径类似于siRNA途径，尽管具有不同的一组蛋白质(例如，Dcr1, Ago1)。最后一个途径，piwi相互作用RNA (piRNA)，在降解宿主转座子转录物中起作用。这些途径在昆虫中是保守的，一些蛋白质在某些物种中经历了基因复制[66]。杀虫RNAi产物预计通过siRNA途径加工，其中外源dsRNA分子被细胞吸收，如上所述加工，导致基因抑制，尽管其他两种途径在该功能中也起着较小的作用[67]。

4.2. 杀虫特性

任何数量的生理上重要的基因都可能成为RNAi抑制的靶标。理想的RNAi靶标是高表达、mRNA库大、对RNAi敏感、编码半衰期短的蛋白质的基因[68]。如果RNAi在昆虫中只是一个短暂的反应，那么dsRNA处理可能不会影响长寿命的蛋白质。冈比亚按蚊(Anopheles gambiae Giles)对候选RNAi靶点的筛选发现，在以酵母为食的幼虫中，抑制肌动蛋白(一种白细胞受体复合体成员)和偏离基因具有杀虫作用，可产生针对这些靶点的短发夹RNA[69]。这项研究还表明，在实验室试验中，这种治疗导致高达100%的死亡率。几丁质合成酶基因也是昆虫中常见的RNAi靶标。几丁质合成酶1 (CHS-1)参与角质层的几丁质合成，而几丁质合成酶2 (CHS-2)则合成周营养基质中的几丁质[70]。抑制蚊子体内这些基因可导致几丁质形成减少和对杀虫剂(如双氟虫脲)更敏感[71,72]。Munawar等[73]综述了6种蚊子的其他靶点。靶标选择是开发基于rna的杀虫剂的许多重要步骤中的第一步，优化它们的递送有许多考虑因素。

4.3. 实施的障碍

创造高效的基于RNAi的杀虫剂需要了解特定害虫的特性。例如，甲虫通常对dsRNA处理非常敏感，低剂量的dsRNA可以实现90%以上的靶标抑制。相比之下，飞蛾和蝴蝶对治疗相当难治[74,75]。许多因素可能导致这些差异，包括dsRNA分子的稳定性、昆虫细胞中dsRNA的摄取和加工、核心RNAi机制的表达以及RNAi的病毒抑制因子等[75]。目前，对于这些潜在的障碍如何影响库蠓的RNAi效率知之甚少，但这些都是开发RNAi作为这些牲畜害虫管理工具的重要因素(图2)。

其中一个障碍是降解dsRNA分子的酶的表达，导致昆虫的低RNAi反应。这些酶被称为dsrna降解酶或核酸酶(dsRNases)，它们的丰度、多样性、组织特异性表达和活性在许多昆虫目中被研究[76,77,78,79]。通过RNAi抑制这些核酸酶来增强RNAi，已经在埃及伊蚊(Aedes aegypti Linnaeus)[80]和瘟蝇[81]中进行了研究，并取得了成功。具体而言，Giesbrecht等人[80]显示了两种幼虫蚊子核酸酶的中肠特异性，这两种核酸酶有助于口服递送的dsRNA的降解。识别和克服这些核酸酶可能是口服递送基于dsrna的控制剂的必要条件。

5. 增强RNAi的策略

克服dsRNA生产、应用、环境稳定性和吸收的障碍是正在进行的研究的途径。考虑到库蠓的栖息地和行为的多样性，可能需要针对不同的库蠓物种制定具体的策略。有许多方法可用于创建更稳定的RNAi产品和大规模生产RNAi产品。

5.1. 纳米粒子

昆虫肠腔和血淋巴中的游离dsRNAs暴露于酶中，这些酶可能会在它们进入细胞并启动RNAi反应之前降解这些分子。由有机或无机、天然或合成材料制成的纳米颗粒可以结合dsRNA分子，减少酶对这些分子的接近[82,83]。壳聚糖是构建这些纳米粒子的常用材料。在这里，带负电的dsrna和壳聚糖聚合物上带正电的氨基之间的静电相互作用导致了纳米颗粒的形成[84]。这些纳米颗粒可以在食物来源中喂给幼虫。一项研究显示，在安家蚕中存在两个几丁质合成酶基因。每天在食物中添加5 μg dsrna -壳聚糖纳米颗粒，连续4天抑制冈比亚幼虫[71]。ch -1和ch -2转录本在不同处理下均被抑制50-60%，导致幼虫出现明显的表型，并增加了幼虫死亡率。同样，Das等人[85]将壳聚糖纳米颗粒的活性与碳量子点和二氧化硅纳米颗粒的活性进行了比较。结果表明，壳聚糖纳米粒子和碳量子点纳米粒子分别抑制了两个基因和一个基因的表达。此外，这些纳米颗粒本身(即与dsGFP结合时)显示出一些杀虫特性。值得注意的是，这些材料是可生物降解的，毒性低，这可以缓解对其在环境中使用的担忧[85]。据推测，开发带有选择性电荷的纳米颗粒和载体化合物可以为昆虫的组织类型递送dsRNA创造特异性[86]。这些进展是改善dsRNA稳定性和提供杀虫处理的有希望的途径。

5.2. RNA结构

在设计dsRNA分子时，互补碱基序列被一段非互补碱基分开，从而促进环的形成。一个常见的例子是短发夹RNA (shRNA)分子，在非互补碱基形成的靶序列的一端有一个单环。它们广泛用于蚊子研究，可以在体外合成或在微生物系统中表达[80,87,88]。这些分子有效抑制靶基因，并在细胞和动物模型中通过抑制RNAi减少虫媒病毒复制，从而增强昆虫的抗病毒活性，减少病毒在载体物种中的传播[89,90]。

作为shRNA的替代品，Abbasi等人[87]构建了两端都含有封闭末端的RNA分子，并将其命名为回形针RNA (pcRNA)。作者表明，这些pcRNA (23 bp)分子与长dsRNA (200 bp)分子以及siRNA和shRNA (23 bp)分子一样有效。重要的是，他们还表明pcRNA通过一种不同于shRNA和长dsRNA的新机制被细胞吸收。这一发现特别重要，因为对RNAi的抗性机制之一是通过抑制长dsRNA的摄取。在Diabrotica virgifera virgifera LeConte(鞘翅目:金莺科)中，暴露于靶向Snf7的dsRNA的甲虫在反复暴露后对dsRNA产生抗性，因为肠道内dsRNA摄取减少，而不是dsRNA降解，导致RNAi效果降低[91]。随着基于rnai的昆虫防治产品的开发，这项工作的意义将需要更详细地探索。然而，次级RNA结构可能会在昆虫细胞中产生更有弹性的dsRNA分子。

5.3. 细菌表达

在微生物中表达dsRNA为体外大量生产dsRNA提供了另一种选择。一种常用的方法是使用含有倒置T7启动子的L4440质粒为目标dsRNA创建表达模板。一旦质粒构建完成，它就可以转化到细菌中，例如HT115 (DE3)大肠杆菌菌株，该菌株缺乏RNaseIII，从而阻止了dsRNA产物的降解。然后用异丙基β-d-1-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导合成。Ahn等人[92]概述了这一过程，并比较了生产后从大肠杆菌中释放dsRNA的热和超声方法。在这项研究中，作者发现25 mL培养体积的dsRNA产率估计分别为488 μg, 238 μg和97 μg，超声波，加热和传统收获方法。在另一项研究中，用乳糖而不是IPTG诱导大肠杆菌，并用氯己定裂解以释放dsRNA，作者认为这是先前描述的廉价替代品[72]。在这项工作中，400 ng dsRNA处理后，埃及伊蚊幼虫的几丁质合成酶a抑制率达到50%，4天后4龄幼虫死亡率达到50%。将表达dsRNA的大肠杆菌直接应用于饲养水中，或将其掺入食物来源中，也可能有助于在昆虫肠道中传递和保护dsRNA。Taracena等人[93]表明，这种方法也可用于通过糖来喂养成年蚊子。大肠杆菌餐实现显著的目标敲除。最近的一项研究也描述了产生dsRNA的大肠杆菌产生的小细胞，这导致dsRNA的保护性包封用于真菌控制[94]。该技术适用于多种害虫，值得进一步研究在库蠓中的应用。

研究人员也在探索工程共生细菌表达dsRNA的效用。一项研究使用了一种表达dsRNA发夹的共生体，靶向恰加斯病的一种媒介——Rhodnius prolixus status，作者发现成年雌性的靶mRNA水平显著降低，产卵量减少[95]。另一项研究评估了蜜蜂及其相关肠道细菌Snodgrassella alvi中共生体的表达，该细菌产生针对瓦螨的dsRNA[96]。这种共生体成功地在蜜蜂肠道中定植，显著降低了取食螨的存活率。共生细菌可能是一种理想的传递系统，因为它们与目标物种和宿主的某些组织趋向性密切相关，但将工程共生体传递到宿主并使其在宿主之间传播的传递方法需要进一步发展。

5.4. 真菌表达

也许在微生物系统中大规模生产dsRNA最有前途的方法之一是使用酵母(Saccharomyces cerevisiae)[88]。这种生物的独特之处在于它的生产可扩展性和干燥后的稳定性。与表达dsRNA的热杀细菌相比，酿酒葡萄球菌在蚊子幼虫生物测定中表现同样有效(死亡率高于75%)[69]。同一个研究小组后来发现，以酵母为基础的杀幼虫剂表达shRNA，靶向嗅觉受体神经元(sema1a)，对伊蚊具有很高的杀灭效果。堪萨斯州斯库斯白纹伊蚊冈比亚蚊和致倦库蚊死亡率超过80%[97]。这个小组已经开发了针对蚊子生理的多种基于酵母的杀虫治疗方法[98,99,100]。酵母提供了一些增加的稳定性，因为它们可以很容易地在蚊子幼虫环境中干燥和重组[88]。

5.5. 病毒

病毒为dsRNA提供了一种独特的递送选择，因为它们可以被设计成递送表达dsRNA的核酸构建物，病毒样颗粒可以作为空血管将dsRNA货物递送到细胞中[101]。Gu及其同事[102]构建了含有shRNA构建物的重组蚊致密病毒。埃及伊蚊蚊V-ATPase。他们的研究结果表明，病毒对多种蚊子组织具有广泛的亲和力，在细胞和幼虫中抑制靶标，并且通过浸泡暴露于病毒后幼虫死亡率增加。此外，植物类病毒为dsRNA的产生提供了独特的支架，并已被证明在D. virgifera中具有杀虫作用[103]。病毒宿主特异性、基因组类型、组织趋向性、传染性和持久性是在开发这些途径用于叮咬蠓的RNAi害虫控制时应考虑的因素。

5.6. 藻表达式

水生昆虫或具有水生生命阶段的昆虫，在自然生态系统中很可能会遇到藻类。在一些研究中，这些生物已被研究作为蚊子控制的dsRNA生产系统。一组设计了莱茵衣藻叶绿体，在An中产生靶向3-HKT的dsRNA[104]。作者报告了饲喂转基因藻类的幼虫可显著抑制靶标并增加其死亡率。另一项研究使用相同的微藻在Ae中表达针对HR3的dsRNA。埃及伊蚊，同样发现与对照相比，靶抑制和幼虫死亡率增加[105]。其他研究使用了衣单胞菌和小球藻，其中包括从相关研究机构附近的水源中收获的菌株来杀死伊蚊。埃及伊蚊和伊蚊。白纹伊蚊幼虫[106,107]。这些研究是有希望的，因为它们已经显示了实验室和自然藻类菌株的成功转化。此外，Fei等[107]在半田间试验中发现他们转化的小球藻具有杀幼虫作用。虽然这些研究很有希望，但改变害虫自然环境特有的其他藻类物种和菌株可能不那么容易。对于这些藻类的成功工程，有许多考虑因素，在这里进行了回顾[108]。

6. RNAi技术在库蠓防治中的应用前景

第一篇研究库蠓RNAi的论文利用培养细胞表明BTV(一种dsRNA病毒)可能被Dcr2降解，并产生21 nt病毒衍生的小干扰RNA (viRNA)分子[109]。Mills等人[110]描述了通过RNAi降低成年索诺氏梭菌靶基因转录水平的实验。作者发现，核心的RNAi机制(即Ago2, Dcr2和R2D2)存在于索诺索球菌中，并且在5天后胸腔内注射dsRNA导致约45%的转录抑制。这些结果表明，至少通过注射，索诺氏梭菌对dsRNA敏感，并且RNAi途径是有效的。

然而，将这些发现转化为控制库蠓的治疗方案需要更多的基础工作。Silver等人[82]和本研究回顾的方法包括裸dsRNA处理、将dsRNA与纳米颗粒络合、使用病毒载体以及在微生物系统中表达dsRNA。这些处理可应用于潜在的或已知的库蠓幼虫栖息地，以控制蠓幼虫。库蠓是多面手食性动物，因此预计会消耗细菌、真菌和藻类。已经开发出用于幼虫蚊子的水凝胶诱饵，以容纳吞噬刺激剂和杀虫剂[111]。然而，这些配方是为了漂浮在水面上。库蠓幼虫只栖息在最初几厘米的基质中，以促进呼吸。理想情况下，处理将被分散到这些系统中，并纳入池塘、泥泞洼地、堆肥和粪肥的浅基质中。或者，糖饵或含有dsRNA的类似引诱剂可用于瞄准成虫[10,93]。

基于RNAi的控制方法的预期结果包括死亡率和病原体传播的改变。在库蠓幼虫中，这些基因可能针对蚊子文献中发现的生理上重要的基因。例如，抑制几丁质合成酶可以影响幼虫在蜕皮和化蛹过程中的角质层形成，减少幼虫肠道中营养基质的形成。联合治疗可能有助于提高疗效。细菌和其他破坏营养基质完整性的干扰物可以降解库蠓的肠道完整性，化学几丁质合成酶抑制剂如双氟苯脲可以改变蜕皮效率[71,112]。一个有趣的目标是性别选择途径。在蚊子中，研究瞄准了导致雌雄比例改变的基因，这表明有希望减少雌性种群(即吸血阶段)[113,114]。其他靶点可能影响病原体在宿主中的适应性、昆虫的繁殖力和昆虫寻找宿主的能力。

与传统杀虫剂相比，基于RNAi的昆虫防治最重要的方面可能是其高特异性和低脱靶效应。Dietz-Pfeilstetter等人对美国和欧盟审查dsRNA产品的监管框架进行了审查[115]。这些作者和其他人鼓励对非靶生物进行毒性研究，以确保特异性[116]。一项研究还检查了哺乳动物系统的口服毒性，没有发现不良后果[117]。这些考虑不仅对科学界很重要，而且对公众的看法也很重要。一项研究让社区成员参与到一个潜在的治疗地点，计划使用酵母基dsRNA杀虫剂[118]。这组作者发现，这个群体精通蚊子生物学，如果新的杀虫剂是安全的，他们会对它们持开放态度。已提出的下一代库蠓控制方法包括昆虫不育技术、沃尔巴克氏体不育和转基因改造[119]。其中许多技术尚未在大型系统中经过测试，可能会招致公众的批评。RNA干扰方法可能更容易被昆虫群体所接受，因为它们不影响昆虫的基因组，并且具有短暂的特性。然而，任何转基因生物的释放，包括这里讨论的那些(即细菌、真菌和藻类)，都需要仔细的评估和监管部门的批准，特别是在自然地区。

7. 结论

通过培养方法和化学和生物杀虫剂有效控制库蠓一直是这些昆虫的挑战。基于RNAi的杀虫剂是该领域令人兴奋的进步途径，但在广泛实施方面并非没有障碍。有效的控制将需要找到抑制目标蠓种的理想基因，优化给药方法，设计在环境中高效和稳定的应用方法，监测对目标和非目标蠓种的影响，并与监管机构和公众合作获得批准和接受(图3)。关于库蠓RNAi的许多基础研究仍有待检验。但是这一领域具有巨大的潜力，因为这种产品可以大大减少对对非目标生物和环境有有害影响的广谱杀虫剂的需求。鉴于目前缺乏有效的防治策略，库蠓是开发先进杀虫剂的重要目标。

https://doi.org/10.3390/pathogens12101251