长尾木霉几丁质酶对棉蚜的防治作用

昆虫病原真菌被认为是一种潜在的微生物生物防治剂，因为它产生各种次生代谢物和酶，可以作为杀虫剂和生物农药。植物很容易受到病原体的攻击，通常，植物中编码了各种抗性基因来赋予抗性。现在几丁质酶基因可以像苏云金芽孢杆菌一样发挥作用，Bt基因被转移到转基因棉花上是为了保护环境免受农药的过度使用。据报道，许多真菌菌株的微生物几丁质酶在很宽的温度和pH范围内都是稳定的，同时对禾草茎螟虫和其他鳞翅目害虫也显示出有效的效果。Chit1是从长直链扁桃体EPF (T. longgibrachiatum)中分离得到的，EPF属糖基水解酶家族18(图 1)。不溶性几丁质可以通过几丁质结合域46与几丁质酶特异性结合。从哈兹菌中分离出几丁质酶基因，并在马铃薯和番茄中表达，结果表明，该基因对两种试验植物的生长发育均无不良影响。

图 1. 长尾木霉内生几丁质酶的系统发育分析

本研究旨在评价Chit1在棉花植株中的瞬时表达及对棉蚜的综合防治效果（图 2）。通过将所需基因转移到目标棉株上，初步分析了转基因产物的正常功能。用几丁质酶测定其内源性几丁质酶的活性，结果表明，长尾盘藤转基因植株(FCBP-EPF-1491) 6天后的几丁质酶活性为0.55 U/mL。而在此之前，孵育4天后几丁质酶活性为0.585 U/mL 48。几丁质酶活性在酵母发酵3 ~ 4天后达到最高。在37ºC49条件下，添加10%胶体甲壳素培养2 h，活性为6.96 ~ 46.49 U/mL。在我们的研究中，记录到长achiachiatum Chit1转基因植株的几丁质酶活性为0.55 U/mL。在植物中观察到长尾藤产生几丁质酶50，最高产量为6.45 U/mL。不同种类的木霉根据底物产生不同浓度的酶。在离体条件下，革氏T. gamsii、绿氏T. virens、长柄T. long gibrachiatum和曲霉T. asperellum的几丁质酶产量分别为0.151 U/mL、0.107 U/mL、0.228 U/mL和0.164 U/mL。其中，在最佳条件下，长尾藤的几丁质酶最高产量为0.228 U/mL 51。几丁质酶的产量因底物、pH和温度的不同而不同。同一真菌菌株的不同分离株可产生不同浓度的几丁质酶。几丁质酶产生的活性通常随着潜伏期的改变而改变。但是，孵育超过6天，几丁质酶的数量减少。在pH 4.0 ~ 5.252范围内，大多数真菌菌株的几丁质降解活性增强。本研究解释了对照植株和接种植株真菌分离物的总体产量和酶产量的差异。

图 2. 查看CLCrV

植物中的几丁质酶通常与植物抵御有害植物病原体的安全性有关。大多数被诱导的植物表现出轻微的症状，这证实了所需基因在植物中的成功转化。在CLCrV中，植株通常产生浅色的叶脉和向下卷曲的棉花叶片，这证实了转化和非转化棉花植株的区别。在拟南芥和拟南芥这两种模式植物中，病毒诱导的基因沉默的情况下，与烟草响尾蛇病毒相比，表现出严重的症状发展53,54。结果表明，长尾盘尾通Chit1转基因植株经虫食144 h后，若虫死亡率约为38.75%。棉蚜成虫取食转化棉植株120 h后开始死亡。Chit1转基因棉成虫死亡率最高，为21.67%（图 3）。

图 3. 棉蚜四龄虫和成虫对几丁质酶转基因植株的死亡率

几丁质酶的使用彻底改变了农业部门，因为它改变了化学农药的使用。以前有报道称，长尾藤几丁质酶被广泛用于减少根结线虫(Meloidogyne javanica)的数量55。金龟子绿僵菌和哈氏僵菌的真菌酶和培养滤液对棉铃虫和蚊子有毒性56,57。生物防治的死亡率和效果的差异通常取决于真菌菌株的使用和昆虫的种类。在未来，强烈建议使用协同基因来提高生物防治的整体效率。建议考虑利用RNAi (RNA干扰)技术来防治最经济的农业害虫。

综上所述，真菌几丁质酶可广泛用于控制不同形态状态的农业害虫，包括昆虫和线虫。棉花植株对长颈结霉Chit1基因的整合表现出很大的灵活性。Chit1对棉蚜的防治效果良好。与Bt制剂相比，真菌几丁质酶制剂的使用较少。因此，迫切需要研究配方，所有可能的真菌菌株的影响及其对害虫的影响，以便大规模用作生物防治剂，以保护环境免受农药的致命和亚致命影响。今后，可以从不同的昆虫病原真菌中分离到更多的几丁质酶基因，用于提高转基因棉花的毒力。

https://doi.org/10.1038/s41598-023-39965-y