未来植物病原真菌管理的RNA干扰策略:展望与挑战

植物病原真菌是农作物上最大的一类致病因子，对世界范围内的农业构成持续和重大的威胁。基于使用杀虫剂的传统方法引起了社会对环境和人类健康影响的关注，迫切需要可替代的防治方法。RNA干扰(RNAi)技术在各种模式和非模式生物中的快速改进和广泛应用，为将这种转录后基因沉默技术应用于真菌病原体的管理提供了初步框架。近年来的研究表明，在植物上外源应用双链RNA (dsRNA)分子靶向真菌生长和毒力相关基因，对不同寄主的灰霉病菌(Botrytis cinerea)、菌核菌(Sclerotinia sclerotiorum)和禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)等病原菌具有疾病衰减作用。这些结果表明外源RNAi在RNAi介导的植物病原真菌病害控制中具有很大的潜力。dsRNA的生产可以通过体外或体内合成来实现。在这篇综述描述了外源RNAi参与植物病原真菌，并讨论了dsRNA的生产，配方和RNAi传递方法。在开发针对真菌病原体的RNAi策略时所面临的潜在挑战，如脱靶效应和表观遗传效应，以及它们可能的解决方案也进行了讨论。

1. 介绍

自从农业出现以来，病原体就严重降低了作物的生产力，农民们一直在探索保护作物免受这些生物侵害的方法。目前，使用合成农药是全球集约化农业系统保障粮食供应不可或缺的手段，可保护作物免受病原体侵害，否则将造成30%以上的产量损失。使用合成农药已有悠久的传统，这些农药已被开发并应用于控制病原体。然而，随着病原菌对农药耐药性的演变，以及对环境和人类健康的关注，刺激了对更具选择性、环境友好型和成本效益的病原菌和害虫替代控制方法的需求。科学家们已经投入了大量的智力精力来寻求减少作物损失的替代策略，例如开发对病原体和害虫具有耐性/抗性的植物，以及通过使用传统育种和植物生物技术工具提高质量的产品。最近，通过RNA干扰(RNAi)进行基因沉默为精确育种和开发保护植物免受病原体和害虫侵害的新产品提供了新的机会。RNAi是由双链RNA (dsRNA)分子触发的一种保守的真核生物机制。它与多种真核生物调控过程有关，包括对病毒感染的保护、转座子运动的控制、基因组稳定性的调控、基因表达和异染色质形成。

Napoli及其同事首次报道了RNAi产生紫色矮牵牛花，通过引入转基因，编码类黄酮生物合成关键酶的查尔酮合成酶基因(CHS)过表达，导致意想不到的白色矮牵牛花表型。进一步分析发现，内源和外源导入的CHS基因表达均下降，由此得出转基因共抑制内源CHS基因的结论。在丝状真菌粗神经孢子菌(Neurospora crassa)中也报道了类似的现象，转基因“albino-1”的引入导致了内源基因的抑制。同样，在秀丽隐杆线虫中，注射dsRNAs导致unc-22基因沉默，该基因与所递送的dsRNA分子序列高度同源。在过去的二十年中，对RNAi的理解已经从最初对意想不到的表达模式的观察发展到对许多生物体中调节基因表达的多方面机制网络的更深入理解。因此，RNAi作为一种环境友好型的农业害虫和病原体防治方法正受到研究的关注。事实上，由于其序列依赖的作用方式，RNAi技术在植物保护方面具有巨大的应用潜力，包括控制昆虫、螨虫、植物病原体、线虫和杂草。

这个概念是基于小RNA (dsRNA/siRNA)分子的管理，诱导病原生物中关键基因的沉默，从而限制/停止它们的生长。将dsRNA传递到目标生物是决定RNAi技术在作物保护中是否成功的一个关键方面。通过宿主诱导的基因沉默(HIGS) RNAi方法可以实现递送，对应于在植物内表达针对害虫/病原体关键基因的siRNA。除了HIGS外，外源性传递dsRNA也可以被认为是一种替代方法。本文综述了通过外源递送小RNA分子靶向植物病原真菌的RNAi方法的研究成果。小RNA生产技术，潜在的限制，和解决方案的RNAi应用于真菌疾病控制也进行了讨论。

2. 植物病原真菌抗性的RNAi研究

过去，RNAi在植物中的应用主要是通过沉默易感基因(即负向调控植物防御反应的基因)来提高植物的抗病能力。然而，在过去十年中，RNAi已被更多地用于为植物提供所谓的“病原体来源抗性”，其中抗性是通过能够沉默对感染或病原体生命周期重要的基因的小干扰RNA (siRNA)实现的。沉默过程开始于细胞质中dsRNAs被Dicer或Dicer样同源物和sRNA特异性RNase III家族酶切割成21 - 25个核苷酸长的双链siRNA。Dicer蛋白包含一个 N端解旋酶结构域、一个Piwi/Argonaute/Zwille (PAZ)基序、一个dsRNA结合结构域和两个 C 端RNase III基序。然后，Dicer生成的siRNA被整合到多组分蛋白质复合物中，即RNA诱导沉默复合物(RISC)，该复合物在siRNA双链的ATP 依赖性解绕时被激活。RISC含有一种Argonaute蛋白，该蛋白具有sRNA结合结构域和裂解靶RNA的内核裂解活性。siRNA一旦被整合到RISC中，就会被解压缩成引导链和乘客链，后者会被降解，引导链会结合到目标mRNA序列上，刺激其内核裂解或抑制翻译。虽然大大减少，但可以检测到残留的mRNA水平。因此，RNAi介导的特定基因沉默通常被称为“敲低”而不是“敲除”。在真菌王国中，在N. crassa中研究了RNAi的机制。从那时起，RNAi机制在广泛的真菌物种中得到了认可。RNAi作为一种靶向修饰真菌基因表达的反向遗传学工具的使用正在不断增加，大量真菌物种已经被证明对RNAi有反应。此外，吸收的外源RNAi分子的功能在确保真菌基因表达所需的影响方面提供了出色的适应性和灵活性，即使不需要对目标病原体进行遗传修饰。转基因(共抑制)、反义或dsRNAs刺激的这种基于同源性的基因沉默已在几种植物病原真菌/卵菌中得到证实，包括不同的霉菌真菌，如灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、草神经孢子菌(Neurospora crassa)和菌核菌(Sclerotinia sclerotiorum) ;稻瘟病、枯萎病和锈病真菌，如亚洲镰刀菌、谷物镰刀菌、稻瘟病菌和小麦纹状锈菌;霉病，以及其他，如蓝灰虫、青椒和不均等Venturia。在过去的几年中，各种靶基因被用来测试RNAi是否在植物真菌病原体中起作用(表1)。迄今为止，成功研究的导致真菌生长发育减少的候选基因数量有限，包括效应物、细胞壁延伸、几丁质酶和己糖转运基因。鉴定合适的真菌候选基因还有很多工作要做。幸运的是，有机会建立高通量筛选管道来寻找强有力的候选人。

表 1. 检测控制病原真菌和卵菌的代表性潜在靶基因

3.小RNA生产技术

目前，外源应用dsRNA是一种很有前景的农业病原控制RNAi策略。为了实施外源性方法，已经成功地使用不同方法产生的序列特异性小RNA分子进行了沉默实验(表2)。dsRNAs的生产可以通过体外合成或体内合成来实现。研究表明，将体外合成的靶向真菌必需基因的dsRNAs应用于植物叶片表面，通过抑制真菌生长、改变真菌形态、降低致病性等方式减轻真菌感染，使植物病害症状变弱。体外方法包括酶转录或化学合成，两者各有优缺点。酶转录方法对于生产短和长dsRNA分子都具有成本效益。该方法是一种基于两种单链(义和反义)RNA (ssRNA)退火的纯dsRNA来源。基于体外转录的原理，在线性化DNA模板或pcr生成的模板上，使用市售试剂盒生产dsRNA被广泛使用。使用体外方法生产dsRNA，在表3中列出的大量病例中已经实现了真菌耐药性。然而，当需要生产大量dsRNA时，这些试剂盒是昂贵的。因此，对于大规模应用的RNAi研究，酶转录方法并不是生产dsRNA的实用手段。另一方面，化学合成可以生产大量高纯度的dsRNA，但其成本较高，随着dsRNA长度的增加，合成成本也会大幅增加[104]。siRNA的化学合成可以控制siRNA的数量和纯度，也允许化学修饰来提高稳定性，这是递送所需的重要特征。化学合成的siRNA可以通过荧光显微镜标记来评估siRNA的摄取或定位。

表 2. 不同双链RNA (dsRNAs)/小干扰RNA (siRNA)生产方法的优缺点

表 3. 植物病原真菌/子囊菌外源应用RNA分子综述

利用基因工程细菌(如大肠杆菌和丁香假单胞菌)和酵母(脂解耶氏菌)在体内生产dsRNA成为了一种低成本生产大量dsRNA的替代方法。例如，在成本方面，可以从低成本公司购买到由细菌(大肠杆菌)产生的真菌衍生的dsRNA序列，价格约为每克1美元。这些系统能够产生现场试验应用所需的大量dsRNA分子。Tenllado等人证明，通过简单的程序将细菌表达的dsRNAs粗提取物喷洒到植物表面，可以有效保护植物免受病毒感染。利用重组细菌生产dsRNA是一种高效的技术，因为它们易于处理，能够维持质粒，并且细菌的生长速度快。在现有的大肠杆菌菌株中，HT115 (DE3)被广泛用于产生大量的dsRNA进行外源性应用研究。大肠杆菌HT115 (DE3)含有噬菌体前λDE3，编码IPTG诱导的T7聚合酶基因，用于dsRNA转录。尽管如此，细菌生产系统可能包含细菌同源DNA分子;dsRNA粗提物可以应用于植物上，测试其对植物病虫害的防治效果。研究人员证实，细菌表达的dsRNAs可用于在真菌、病毒、线虫和害虫中诱导RNAi。研究人员还利用含有噬菌体phi6 RNA依赖的RNA聚合酶复合物的丁香假单胞菌进行体内dsRNA扩增。Niehl及其同事证明了丁香假单胞菌在体内产生的dsRNA具有很大的潜力，可以设计和生产治疗性dsRNA，用于大规模的作物保护，以对抗不同的真菌和病毒病原体以及害虫。然而，大肠杆菌的使用仍然存在争议，因为即使作为含有dsRNA的裂解物使用，其残留物也可能对动物和人类健康产生影响。因此，正在探索在生物体中表达dsRNA的替代方法，特别是那些通常被认为对人类消费是安全的、不会产生内毒素或对健康或环境构成风险的替代方法。酵母是具有这种特性的一种生物，它可以为生产dsRNA提供独特的优势。Alvarez-Sanchez等发现脂质体是产生和传递dsRNA-ORF89的方便宿主，可以保护虾免受白斑综合征病毒的攻击。

除了其他因素外，基于RNAi的产品在控制真菌病原体方面的作用取决于生产成本。考虑到成本趋势，随着商业公司对dsRNA生产能力的投资，预计未来小RNA的生产成本将大幅下降。在过去几年中，dsRNA的生产成本有下降的趋势。例如，使用体外三磷酸核苷(NTP)合成生产1g dsRNA的成本从2008年的12,500美元下降到2018年的60美元。对于田间规模的害虫和病原体管理，将需要公吨的dsRNA。可想而知，如此巨大的需求，单靠体外的dsRNA转录系统是无法满足的。由于这个原因，一些工业公司已经实现了利用细菌低成本(每克dsRNA几乎2美元)和大规模生产dsRNA。

4. 小RNA外源传递控制植物真菌病原菌

外源性递送方法无疑是RNAi技术在该领域应用的最有前途的方法。这种方法避免了对作物基因组的任何修饰，并且可以用来对付几乎任何对RNAi方法有反应的微生物病原体。因此，外源性方法可以作为HIGS的替代方法，更容易被公众和生物安全当局接受，并且比获得HIGS植物更快地优化。第一个观察结果，解释了dsRNA分子在植物上的外源传递，诱导植物基因的RNAi，是在用表面活性剂Silwet L-77预处理的benthamiana植物中报道的。在本研究中，将体外转录的685 bp dsRNAs和/或化学合成的靶向内源性植物烯去饱和酶mRNA的21-nt sRNAs喷洒在植物表面，导致植物烯去饱和酶广泛下调。在外源性RNAi机制中，要诱导RNAi并成功实现对病原体的保护，两个先决条件是基本的:i)目标生物对dsRNA刺激的沉默过程的敏感性;ii)真菌病原体、病毒和昆虫从环境中摄取外部RNA分子的能力。植物和真菌能够吸收外部施加的dsRNA和siRNA。有报道表明，真菌可以摄取21nt的sRNA双链以及至少800 nt的长dsRNA。Dicer、Argonaute和RdRP蛋白在几种真菌物种中的存在表明它们应该能够表现出活性RNAi机制。然而，小RNA的外源性递送到真菌可能是棘手的，对于一些真菌物种尚未实现。一些真菌物种不愿摄取RNA的原因很难探究，可能与不同的生物学方面有关，包括细胞壁或膜生化成分。例如，酵母编码RNAi机制的核心成分，但仍然对dsRNA不敏感。作者通过活细胞成像证明了小麦芽孢杆菌的分生孢子不能吸收dsRNA，这表明可能没有编码的dsRNA受体或摄取途径存在缺陷。Wang和同事报道了灰葡萄孢杆菌从环境中快速摄取dsRNA，这些RNA能够以序列特异性的方式抑制真菌基因。在菌核菌中，一项科学研究表明，dsRNA的摄取是通过网格蛋白介导的内吞作用发生的。最近的少数研究之一报道了各种有益或致病的真菌和卵菌生物具有不同的能力，从环境中吸附荧光素标记的dsRNA，当通过喷雾诱导基因沉默(SIGS)方法靶向毒力相关基因以防御宿主时，这种能力似乎对RNAi的功效有影响。作者发现，gloeosporioides不能摄取dsRNA，而在木霉和疫霉中，RNA的摄取是有限的。在灰葡萄孢菌、核核菌核菌、茄根丝核菌、黑曲霉和大丽黄萎病菌中则不同，在给予特异性长dsRNA后6小时内荧光dsRNA已经进入真菌细胞。总的来说，真菌对dsRNA摄取的信息很少，这是由于迄今为止关于外源RNAi对植物病原真菌的功效的研究数量有限。

4.1. 小RNA的配方

使用外源性RNAi的总体成功取决于RNA分子的递送方式、应用方法、dsRNA的长度和/或浓度、植物器官特异性活性以及在不适当环境条件下的稳定性。裸dsRNA外源应用的主要限制是它们的短期稳定性。dsRNA与载体分子络合是一种广泛用于克服这一限制的解决方案。虽然大多数关于dsRNA载体用于植物保护的研究都集中在昆虫上，但一些配方的稳定性和渗透性的提高也可能应用于植物病原真菌。预测何时会发生真菌爆发是很棘手的，因此，植物表面的保护性抗真菌治疗保持完整的时间越长，当感染发生时就越有可能成功。此外，多种坏死性病原体，如菌核菌，可以在几天内在植物内变成系统性的。这强调了尽快将优化的dsRNA负载进入真菌的重要性，这可以通过增强穿透性的载体来完成。为了提高稳定性和吸收效率，可以将dsRNA掺入纳米颗粒中。纳米颗粒是将不稳定的裸dsRNA/siRNA递送到目标位点的最常见选择，因为它们可以保护dsRNA/siRNA免受降解。此外，它们还可以通过在其表面添加靶向配体进行靶向递送来使用。壳聚糖(聚β-1,4-二氨基葡萄糖)是一种应用最广泛的聚合物，用于生成纳米颗粒，以保护和传递dsRNA/siRNA到靶细胞。壳聚糖由于其从海洋废物中廉价生产，低毒性，以及各种分子量和可用改性而成为许多研究的主题。研究表明，壳聚糖为基础的配方提高了多种昆虫的内切酶稳定性和吸收。另一种提高RNAi效率的方法是使用层状双氢氧化物粘土纳米片。带正电荷的纳米片堆叠通过静电结合带负电荷的dsRNA，增强了对环境因素和核酸酶的保护。Mitter等人报道，将RNAi诱导的dsRNA装载到层状双氢氧化物粘土纳米片中，并施用于植物表面，可以使dsRNA持续释放长达30天。配制的dsRNA (Bioclay)在喷洒后可提供长达20天的病毒保护，而裸dsRNA仅提供5天的保护窗口。由于这种生物活性的增加，这种技术也有可能在昆虫和真菌防御中发挥作用。有趣的是，这种配方似乎也有助于在喷洒的寄主植物中吸收和全身传播。也有报道称，使用一类非常小的纳米颗粒，称为碳点，将siRNA递送到烟叶和番茄植物中。此外，基于脂质体的递送方法已应用于昆虫、真菌和线虫，成功地改变了基因表达和/或死亡率。这里需要说明的是，虽然载体化合物可以极大地促进RNA的传递，但它们也非常昂贵和/或难以合成。在哺乳动物细胞中已经报道了不同的给药策略，如dsRNAs与胆固醇、阳离子脂质和细胞穿透肽结合。未来的研究需要确定它们是否也能提高真菌病原体对dsRNA的吸收和效率。

4.2. 交付方法

在不同的农业害虫物种中研究了不同的施用/递送策略，目前测试的主要dsRNA施用方法包括高压喷雾、注入树干、土壤施用、叶柄吸收、刷体施用、渗透、注射、根浸泡、土壤/根淋和收获后喷洒。当使用高压喷雾外源应用siRNA时，成功地诱导了benthamiana中绿色荧光蛋白(GFP)转基因的局部和全身沉默。在这里，高压喷涂比擦拭、渗透和基因枪技术更有效。在不使用任何额外技术的情况下，直接外源应用dsRNA，通过无菌单个软刷扩散，还观察到在拟南芥中成功诱导有效抑制增强型绿色荧光蛋白(eGFP)和新霉素磷酸转移酶ii (NPTII)转基因。作者分析了不同dsRNA浓度(0.1、0.35和1.0 μl)对转基因沉默效率的影响，0.35 μl浓度对转基因沉默效率的影响更为显著。不同长度的dsRNA(315、596和977 bp)靶向不同病毒基因对烟草叶片的作用也进行了研究，结果表明较短的dsRNA抗病毒活性降低，这表明dsRNA长度可能影响其效果。总体而言，真菌对环境RNA的摄取似乎不太依赖于RNA的大小，因为短RNA双链和长RNA双链都被摄取，并刺激真菌细胞中强烈的基因沉默。

dsRNA的有效递送是将基于rnai的真菌控制从实验室转移到现场的关键。dsRNA不仅在真菌内移动，而且还可以从环境转移到真菌(环境摄取)，以及植物和真菌之间的相互作用(跨界dsRNA运输)，从而在真菌生物中诱导基因沉默。来源于植物真菌病原体基因序列的外源RNA既可以直接内化到真菌细胞中，也可以在转运到目标真菌细胞之前通过植物组织间接传代。植物维管系统转运RNA;事实上，植物中的RNAi与一种移动信号的产生有关，这种信号可以在细胞间远距离传递。因此，这一事实可用于制定控制病原体的有针对性战略。关于植物对HIGS的稳定抗性，外源dsRNA的应用提供了短期的真菌感染保护，但它们可能特别有利于在收获后储存期间保护农业食品和保护没有明确或有效转化方案的植物物种。

对真菌病原菌外源RNAi的研究结果如表3所示，表明外源应用能有效抑制真菌生长。例如，Werner及其同事最近的一项研究表明，使用喷雾诱导的基因沉默(SIGS)，针对F. graminearum的Argonaute和Dicer基因，可以保护大麦叶片免受F. graminearum的感染。同样，当将靶向其肌球蛋白5基因的体外转录dsRNA喷洒在受伤的小麦胚芽鞘上时，亚洲镰刀菌的毒力下降。在另一项研究中，将体外转录的dsRNAs应用于油菜籽(Brassica napus)叶片，靶向59个坏死性真菌基因，减少了S. sclerotiorum和B. cinerea叶片感染。用791nt长的dsRNA喷施大麦离体叶片，靶向麦角甾醇三种生物合成基因CYP51A、CYP51B和CYP51C，可以有效抑制真菌在喷洒dsRNA的局部区域和未喷洒dsRNA的远端叶片部位的生长。这些结果表明，dsRNA可以在植物内转运。在番茄、草莓、狐葡萄(Vitis labrusca)、卷心莴苣、洋葱、玫瑰和拟南芥叶片表面局部应用针对灰霉病Dicer-like (DCL)基因(BcDCL1和BcDCL2)的dsRNA和sRNA，可有效抑制灰霉病。另一方面，在葡萄(Vitis vinifera)上测试了外源应用的dsRNAs对葡萄球菌感染的预防和抵抗能力。采用叶片高压喷药、叶柄吸附dsRNA和收获后喷药三种不同的方法将dsRNA送入植株。结果表明，与施用方法无关，外源方法可以降低灰葡萄孢的毒力。这些成功的外源应用实验表明，外源提供的dsRNA可以为开发一种旨在保护作物免受真菌病害的新工具奠定基础。

外源应用dsRNA也可以非常有趣地应用于收获后阶段的园艺产品和对抗真菌病原体，真菌病原体能够产生对动物和人类健康非常有害的真菌毒素。由于残留问题，它们在处置阶段的控制严格限于几种有效成分。在采后病原体方面，由于BcDCL1/2的dsRNAs和sRNAs，水果、蔬菜和花朵表面的灰绿杆菌生长停止，表明外用小RNA作为控制采后病原体的新一代可持续和环保产品的潜力。此外，应该回顾的是，收获后的产品不会暴露在开放的田间环境条件下，如紫外线，这会促进dsRNA的降解，这使得它们更适合在收获后进行保护。

5. 基于dsRNA的产品在植物疾病管理策略中的挑战

外源应用dsRNA分子已经在很大程度上成功诱导了RNAi(表3)，上面概述的研究强调了在开发基于RNAi的抗真菌病原体产品之前需要解决的几个关键方面。关于外源RNA分子在真菌中的应用，以及解决目前限制RNAi在真菌病原体控制中的可行性的主要问题，需要考虑一些问题。

5.1. 表观遗传效应

如上所述，外源RNAi是现代作物保护平台中一种有效的无转基因方法。在SIGS方法中，RNA分子被外用在植物上，以选择性地触发目标mRNA的降解。然而，一旦存在于植物细胞中，应用的dsRNAs可能被DCL4加工成21-nt siRNA，在转录后基因沉默的过程中切割互补mRNA，被DCL2加工成22-nt siRNA，在互补mRNA上招募RNA定向RNA聚合酶6 (RDR6)生成次级siRNA或抑制mRNA的翻译。最后，DCL3将dsRNA加工成24-nt siRNA，参与同源DNA序列的RNA定向DNA甲基化(RdDM)。因此，在外源RNAi方法中，应用的dsRNAs可以引发意想不到的表观遗传改变，并导致表观遗传修饰的植物。DNA甲基化是指在六环胞嘧啶残基的第五个碳上加一个甲基。长期以来，人们一直认为DNA甲基化是由DNA:DNA相互作用引起的，直到一项开创性的研究表明，RNA:DNA相互作用导致了类病毒感染烟草植株的DNA甲基化，因此被称为RdDM。Dubrovina等在携带GFP/NPTII卡带的转基因拟南芥中体外转录了靶向GFP和NPTII基因的dsRNA。他们观察到，在给药7天后，不仅GFP和NPTII mrna下调，而且相应的编码区也发生了DNA甲基化。因此，来自Dubrovina及其同事的信息似乎反映了一种更普遍的机制，并支持在外源RNAi的应用中更仔细地考虑可能的表观遗传变化，因为外源dsRNA处理的植物可能仍然不含转基因，但它们仍然是表观遗传修饰的。总的来说，外源RNAi应用后基因组中发生的表观遗传变化应该得到解决和澄清。这将有助于更好地解释获得的外源性RNAi数据。

5.2. 生物安全注意事项

由于其序列依赖的作用模式，学术界和商业部门对使用RNAi作为植物稳定表达或局部应用的大量农业害虫和病原体的管理策略越来越感兴趣。基于RNAi的植物已经在商业层面获得了批准(玉米和土豆)，其他植物也准备提交(李子)。对这些进行风险评估的主要问题已经确定。同样的生物安全方法可以用于评估和批准新的基于RNA的产品用于局部应用。下面，我们试图综合外源RNAi应用过程中植物风险评估中需要解决的最重要方面。虽然dsRNA/siRNA的结合被认为是高度特异性的，但siRNA可以结合与靶基因具有足够序列同源性的脱靶基因。靶基因组内其他地方的siRNA结合可能不是问题，但如果脱靶结合发生在非靶生物体中，则担忧会增加。

然而，为了减少对非靶物种的可能影响，可以利用RNAi的序列依赖特性来定制dsRNA序列的设计。事实上，在外源-RNAi机制发展初期，考虑周到的dsRNA设计将会由于序列相似性限制非靶标效应的可能性。设计一个独特的siRNA/dsRNA，不与其他遗传位点具有高的DNA同一性，极大地限制了脱靶效应的可能性。目前用于RNAi实验的siRNA和dsRNA设计指南建议针对序列数据库进行BLAST相似性搜索(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST(于2021年3月4日访问))，以确定潜在的脱靶基因，从而增加仅靶向预期基因的可能性。然而，BLAST算法并不是专门设计来评估RNAi脱靶效应的。因此，专门的生物信息学程序，如开放获取的siRNA查找器(si-FI)软件(https://github.com/snowformatics/siFi21(于2021年3月4日访问);l<s:1> cketal, 2019)， ERNAi (https://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3/(于2021年3月4日访问)和dsCheck (http://dscheck.rnai.jp/(于2021年3月4日访问))也可用于筛选候选dsRNA/siRNA序列是否与其他基因互补。

6. 未来展望和结束语

粮食安全受到包括疾病在内的生产限制的威胁。作物对病原体的保护主要依赖于化学农药的广泛使用，这些农药每年大量施用于环境中。其中一些化学品已经使用了近半个世纪。因此，需要一种更可持续、对环境危害更小的新工具。RNAi是一种新颖而有前途的方法，在许多经济上重要的作物植物中作为一种处理病原体的技术正在取得进展。尽管存在一些限制，但正如大量研究表明的那样，RNAi在提高作物抗性，特别是对病原体的抗性方面的适用性预计将成为未来最可靠和最重要的方法。一般来说，RNAi已成为植物病原体和昆虫最具潜力的控制机制之一。尽管RNAi在植物及其病原体中的分子过程仍有许多有待探索和了解的地方，但根据现有的知识和本文的研究综述，外源RNAi技术是鉴定基因功能和靶向关键基因控制植物病原真菌发育的重要工具。植物内稳定表达可能提供长期稳定的抗病能力。植物内稳定表达提供了长期稳定抗病的好处，但它显然被归类为转基因生物，需要遵循适用于这类转基因植物的规则。另一方面，局部应用为开发新的基于dsrna的产品提供了更灵活的解决方案，用于农业系统中保护作物。尽管关于真菌外部RNA摄取的信息有限，但在真菌中已经取得了有趣的进展，包括灰孢杆菌、亚洲镰刀菌、谷物镰刀菌、Oxysporum、菜籽菌、斐济镰刀菌和菌核镰刀菌。利用RNA分子局部应用的RNAi技术已成为改良多种重要农艺植物的潜在工具。基于rna的生物防治化合物已经在开发中，新的基于RNAi的配方很快就会进入市场，在不同农业部门的应用中具有良好的成本效益平衡。考虑到首批文件的可用性，这一目标现在似乎是可以实现的，其中最重要的一份文件来自经合组织(http://www.oecd.org/officialdocuments/publicdisplaydocumentpdf/?cote=env/jm/mono(2020)26&doclanguage=en(于2021年3月4日访问))，其中指出了这些基于RNAi的新产品的风险评估和监管方法，与申请新生物农药授权的方法一致。

为了开发基于dsRNA的产品，除了鉴定有效的dsRNA序列外，我们还需要根据真菌和植物的类型开发合适的配方和输送系统。生物技术领域的技术进步为特异靶基因的检测提供了新的认识。在真菌中，dsRNA的形成、摄取和加工仍然相对未被描述。分析dsRNA的稳定性和传递方法，更具体地说，分析这些dsRNA进入目标生物体的摄取，仍有待研究。通过纳米颗粒复合物递送dsRNA在作物防治害虫方面具有新的潜力，特别是那些对RNAi具有抗性的作物。dsRNA/纳米颗粒复合物的局部应用有望成为RNAi介导的害虫/病原体控制的未来，而无需对作物进行基因改造。虽然载体化合物大大促进了RNA的传递，但它们也相当昂贵和/或难以合成。已经被用于批准基于rna的植物的生物安全方法可以用于开发新的基于dsRNA的产品的风险评估。应实施现有立法，以考虑批准新的基于脱氧核糖核酸的产品。考虑到这些方面，我们可以想到在这项技术的发展中发挥非常重要的作用，以一种与环境更相容的方式改善植物免受疾病的保护系统，正如欧洲所表明的绿色协议中预期的新线路所预见的那样，世界也感兴趣。

原文链接：

https://doi.org/10.3390/plants10040650