基于 RNAi 的生物农药：鳞翅目昆虫近期研究综述

众所周知，合成化学杀虫剂对于控制害虫至关重要。然而，它们对环境和人类健康的不利影响，以及害虫对这些化学农药的抗药性的出现，迫使科学界寻找有效和可持续的替代品。RNA 干扰介导的害虫管理是实现这一目标的策略之一。RNAi 涉及沉默害虫内的重要基因，使它们无法对农作物造成经济损失。这种技术使害虫管理过程具有高度的针对性和有效性。然而，RNAi 的效率因昆虫种类而异。其中一些害虫高度易感，而另一些则最不敏感。占农业损失大部分的鳞翅目昆虫被认为是这样一类昆虫。这是由于多种因素造成的，例如它们的高肠道 pH 值、特异性核酸酶、siRNA 无法逃逸核内体以及其他限制因素。提高 RNAi 的效率对于将 RNAi 作为传统杀虫剂的替代品商业化至关重要。正在尝试各种技术来克服这些限制。本综述侧重于此类技术及其在害虫管理中的应用潜力。

针对鳞翅目害虫中 RNAi 效率的生物屏障

在鞘翅目动物中，RNAi 是高效的，可用于农业领域商业水平的害虫管理。在鳞翅目动物中，由于多种因素，dsRNA 产生沉默效应的效率大大降低

不适合 dsRNA 的肠道环境

多细胞动物的内脏含有多种酶，以及消化和其他代谢活动所需的其他有机和无机物质。不同的动物根据它们的生活方式和身体新陈代谢进化出不同的酶。已经观察到，肠道内容物的 pH 值在不同的生物体中也不同。鳞翅目昆虫的。RNA 分子在如此高的 pH 值下不稳定，因为它们会在如此高的 pH 值下水解，它们在 4.0-5.0 左右的 pH 值下最稳定。在离体实验中，dsRNA 在幼虫肠道内容物中孵育，结果表明它在 Ostrinia nubilalis（欧洲玉米螟）肠道内容物中的稳定性较差，其肠道 pH 值约为 9.0， Diabrotica virgifera 肠道 pH 值为 5.75，dsRNA 分子进入高碱性肠道后会退化，导致 RNAi 反应效率低下。

特定 RNA 核酸酶的存在

核酸酶是一组能够将核酸切割成更小片段的酶。几乎所有的活细胞都含有这种酶。鳞翅目昆虫与其他昆虫的区别在于存在 dsRNA 分子时上调 up56 基因。这种上调的 up56 基因负责产生 RNAi 效率相关核酸酶 (REase)，这是一种特定类型的核酸酶，其作用与人类核酸内切酶-I 非常相似。这种特定的核酸酶负责 dsRNA 的降解，从而触发基于 RNAi 的沉默。这种将 dsRNA 切割成小片段的机制使得基于 RNAi 的目标基因敲除过程效率低下。

低效的 RNAi 

进入细胞后，dsRNA 被切成更小的片段，称为 siRNA。这些 siRNA 和各种其他蛋白质分子执行所需基因功能的沉默。每个步骤涉及不同的蛋白质。这些蛋白质共同构成了 RNAi 机制。在昆虫中，dsRNA 的细胞摄取依赖于网格蛋白和其他内吞途径。在内吞过程中，dsRNA 分子被转运到内体囊泡中。这些内体囊泡与分选内体融合，将其内容物转移到晚期内体中，dsRNA 可以从这里转移到溶酶体中，溶酶体会降解 dsRNA，因为它含有各种核酸酶，或者 dsRNA 逃出内体以启动基于 RNAi 的基因沉默 。这种 dsRNA 从晚期核内体逃逸到胞质溶胶中在鞘翅目中非常有效，但在鳞翅目中则不然，这从使用荧光标记的 dsRNA 分子的研究中可以明显看出。鳞翅目（Sf9 和 Hv-E6）和鞘翅目（Lepd-SL1 和 TcA）细胞系同样能很好地内化荧光标记的 dsRNA。然而，与鞘翅目细胞不同，鳞翅目细胞从不将 dsRNA 转化为 siRNA，这表明 dsRNA 可能在溶酶体中被分解，因为它们从未逃脱核内体。

dsRNA 加工过程中的另一个障碍是参与将 dsRNA 切割成更小的干扰 RNA (siRNA) 的 DICER 酶的结构变异。RNAi 功效还因特定昆虫物种中存在的 argonaute 基因的数量和类型而异。 Lptinotarsa decemlineata（科罗拉多马铃薯甲虫）对 RNAi 非常敏感，具有 AGO2 基因重复；这些 AGO2 基因是 dsRNA 触发的 RNAi 所必需的。AGO2 在 Bombaxy mori（家蚕）中的过表达产生了高效的 RNAi。对鞘翅目和鳞翅目进行的比较 RNAi 沉默研究已经证实了鳞翅目细胞中 dsRNA 现象的这种低效处理。但是，关于理解这些处理障碍背后的机制的工作很少。等待对潜在机制有更清晰的了解（图 1）。

图 1. 昆虫RNAi 作用机制

提高鳞翅目RNAi效能的研究进展

封装

鳞翅目昆虫肠道内dsRNA的稳定性很低，因此保护dsRNA变得非常重要。基于封装/纳米载体的dsRNA递送已成功用于在恶劣环境下稳定RNA分子，如高pH值，特定核酸酶的作用等。这可以通过将dsRNA与生物来源的纳米颗粒(如脂质、蛋白质、碳水化合物)，甚至是医学中已经用于药物输送的金属纳米颗粒相结合的技术来实现。christiens等人(2018)发现胍类聚合物非常有效地携带dsRNA，并保护它们免受降解。所构建的聚合物的pKa约为9.6，使其具有高碱性，在碱性条件下稳定了携带dRNA的聚合物，从而显著增加了中肠细胞对dsRNA分子的摄取。通过对甜菜粘虫几丁质合成酶B基因的沉默，证实了这一结果，沉默效率为90%。

在另一项研究中，壳聚糖聚合物共轭dsRNA分子对鳞翅目的RNAi效果进行了研究。壳聚糖偶联的dsRNA有助于dsRNA和siRNA在内体逃逸。内体内dsRNA分子的积累减少了60%。

脂质是医学上用于递送dsRNA分子以获得更好RNAi结果的另一类分子。将细胞效应素II分子与dsRNA分子络合，投喂落粘虫幼虫，研究其RNAi效率。研究发现，CFII-dsRNA分子能够比裸dsrna分子更有效地沉默靶细胞凋亡抑制剂(IAP)基因。

蛋白质分子也可用于包封dsRNA分子，其中支链两亲性肽分子被用于在Trobolium castenum中作为胶囊(BAPCs)递送dsRNA分子。在相同条件下，裸dsRNA对同一昆虫品系的死亡率接近75%，而裸dsRNA的死亡率为30%。bbapcs也在甜菜粘虫S. exigua(甜菜粘虫)上进行了测试，但没有与相似条件下的对照组进行比较。在鳞翅目动物中，BAPCs在提高RNAi效率中的作用有待进一步研究。星形多阳离子(SPc)介导的dsRNA传递是纳米载体介导的传递系统的新成员。SPc负载的dsRNA能够在鳞翅目昆虫的蛹和成虫阶段产生67%的RNAi。SPc能够保护dsRNA分子免受这些昆虫中肠中各种酶的作用，从而提高RNAi的效率。纳米颗粒的大小和结构对纳米颗粒/dsRNA复合物的稳定性起着重要的作用，这反过来又决定了这种复合物对rnai诱导的基因沉默的效果。这是通过比较聚l -赖氨酸/dsRNA复合物与聚l -赖氨酸/多酚(−)-表没食子儿茶素没食子酸酯/dsRNA复合物的有效性来证明的，方法是敲除夜蛾(秋粘虫)的荧光素酶基因。聚l -赖氨酸/多酚(−)-表没食子儿茶素没食子酸酯/dsRNA复合物具有66.7%的下调效果，而聚l -赖氨酸/dsRNA复合物的下调效果为47% 。

双链RNA修饰

dsRNA分子的稳定性对于开发基于rna的商业规模害虫管理至关重要。dsRNA容易受到dsRNases的作用，这将它们限制在非常小的片段上，使它们无法产生RNAi应答。串联的dsRNA具有相似序列的多次重复。观察到，与非串联dsRNA分子相比，串联dsRNA分子在很大程度上可以引起沉默。我们还观察到，连接长达500 bp的序列比连接约250 bp的片段更能引起更好的反应，这意味着较长的C-DNA片段导致更高的靶标沉默。引入串联dsRNA分子的另一个重要影响是在Spodoptera furgipedra中Dicer-2和Ago-2基因的表达水平大幅增加。

协同的方法

它们通过产生酶来解毒所使用的农药，使其失效。将细胞色素P450家族等解毒酶的相关基因抑制到一定程度，可以降低对农药的依赖，也使昆虫对植物化学作用敏感。通过简单口服特定的dsRNA分子沉默小菜蛾(小菜蛾)的CYP6BG1基因，可显著降低小菜蛾对氯菊酯(一种化学农药)的抗性。在另一项研究中，对棉铃虫抗氰戊菊酯品系中CYP6B7、CPR和Cyt-b5 3个不同基因进行联合沉默，使其对氰戊菊酯更敏感。

重组表达

与直接给药口服给药相比，dsRNA分子在微生物内部的重组表达使给药过程更容易，成本更低。另一种方法是在作物中表达需要保护的dsRNA分子;也就是说，通过制造转基因植物的基因，产生针对特定昆虫种群目标基因的dsRNA。在一种表达特定dsRNA分子的工程叶绿体中，沉默了棉铃虫中鳞翅目几丁质合成酶(Chi)、细胞色素p450单加氧酶(p450)和v - atp酶基因(导致靶基因沉默到无法检测的水平)。目标棉铃虫发育迟缓，发育受到阻碍。在另一项研究中，使用一种表达针对几丁质合成酶基因(SeCHSA)的dsRNA分子的重组大肠杆菌菌株来传递dsRNA分子，与口服给虫的裸化学合成dsRNA相比，导致甜菜粘虫的死亡率更高(图2)。

图 2. 提高基于dsRNA的RNAi效果的策略

未来展望与挑战

基于RNAi的方法正在接近应用-准备发挥其在病虫害管理中的潜力。加拿大食品检验局和美国环境保护局最近批准使用基于rnai的害虫管理技术，通过使用转基因植物来对抗Diabrotica vergifera。为此，需要解决以下因素，以确保在田间条件下基于rnai的病虫害管理的可持续性。

耐药性的发展

任何有害生物管理技术的主要问题之一是目标害虫对该技术的抗性发展。以表达转基因植物的DvSnf7 dsRNA为食的西方玉米根虫在田间条件下产生了抗性。在基于dsRNA的害虫管理中，有两种可能的方式使昆虫产生抗性，(1)由于RNAi机制相关基因的下调或突变，以及(2)靶器官(主要是肠道)细胞对dsRNA的吸收效率低下或较低。RNAi与其他控制方法(如化学农药或生物控制剂)结合使用，可以降低耐药性发展的风险。这种多策略的方法可以提高害虫防治的整体效果，减少抗性昆虫的选择压力。导致耐药的另一个主要因素是靶基因的多态性和突变。这可以通过筛选更多的潜在靶基因和使用计算生物学技术预测所选靶基因的多态性频率来解决。

非目标物种的研究

RNAi干扰的潜在脱靶效应可能限制该技术在害虫管理中的应用，因为它可能对传粉昆虫和害虫的天敌等有益昆虫构成潜在威胁。基于dsRNAi的RNAi的特异性受一系列规则控制，这些规则可以通过(1)设计特异性和高度保守的siRNA序列来实现，这些siRNA序列专门针对感兴趣的害虫，并最大限度地减少对非目标物种的脱靶效应。(2)进行深入的生物信息学分析，以预测和避免非目标物种基因组中任何潜在的脱靶位点。基于突变分析，评估dsRNA在脱靶物种中触发RNAi的有效性，有报道称(1)dsRNA的序列一致性要达到80%以上才能触发靶基因的有效沉默，(2)dsRNA的完全匹配片段≥16 bp或几乎完全匹配片段> 26 bp且一两个错配很少分布的片段才能触发足够数量的RNAi。基于这些参数设计dsRNA将最终使这一过程更加具体，并将消除任何脱靶效应的机会。

在过去的二十年中，RNAi在生物学中的应用急剧增加。它可以很好地创建基因敲低，以研究许多重要途径和现象的遗传基础。RNAi在鳞翅目昆虫控制中的应用在实验室研究中显示出很大的前景。研究人员已经确定了几个基本基因，当沉默时，可能导致昆虫死亡。RNAi在害虫防治中应用的主要障碍是不同昆虫种类的RNAi效果存在很大的异质性。虽然在本研究中强调了一些可能的困难解释和克服这些困难的方法，但这些工作仅在实验室条件下进行，并且仅限于少数研究。因此，有必要进行大量的调查，以证明该方法在田间条件下对鳞翅目有害生物的治理是有效的。

原文链接：

https://doi.org/10.1007/s12595-023-00489-y