综述：RNAi作为叶面喷雾剂在田间应用的效率和挑战

RNAi技术正越来越多地用于作物保护，以抵御病毒、真菌病原体和害虫。喷雾诱导基因沉默（SIGS）的非转基因方法依赖于直接喷洒dsRNA来诱导RNAi效应，由于其安全性和环境效益以及广泛的宿主范围和高度的靶向特异性，具有很大的应用潜力。然而，随着最近研究表明，一些限制SIGS-RNAi效率的因素已经在昆虫和植物中被认识到。在这篇综述中，评估了目前有关植物叶片和细胞摄取dsRNA分子的知识。以及主要的吸收障碍，包括叶片形态特征和环境因素，并提出克服这些障碍的方法。 

1. 简介

植物中发现的一种称为RNAi或转录后基因沉默（PTGS）的自然调节机制，因其在许多真核生物的各种发育过程、应激反应和抗病毒防御中的作用而被深入研究。植物中的这种机制利用Dicer样蛋白（DCL）将内源表达或外源引入的dsRNA加工成小干扰RNA（siRNA）。然后，这些siRNA双链体结合到AGO蛋白上，随后乘客链被降解。AGOs引导的多蛋白复合物与剩余的引导链形成RISC（RNA诱导沉默复合物），RISC将结合并切割互补mRNA转录物，从而下调基因表达。

自从RNAi被发现以来，RNAi技术在促进植物抵抗病毒、类病毒、线虫、害虫和真菌的潜力已经得到了深入的研究。宿主诱导的基因沉默（HIGS）是一些作物物种中一种有效的RNAi方法，涉及将表达dsRNA的基因盒转化到植物中，然后进行繁殖。然而，许多关键作物品种缺乏转化技术手段，并且转基因开发成本极高，时间长，同时，公众对于转基因生物接受度不高。因此，对非转基因外源性应用方法产生了极大的兴趣。

外源应用的方式可以通过将dsRNA分子传递到植物表面或内部组织，从而有效地触发RNAi途径，而dsRNA分子又可以靶向害虫、病毒和真菌病原体的重要基因。该方法的施用手段主要包括叶面施用、种子处理、木本植物注射以及植物插条或根系吸收等。

随着dsRNA生产系统的发展，dsRNA合成的成本已显著降低，从12000美元/克降至0.5美元/克以下。因此，对于许多阔叶作物和园艺作物的大规模保护，叶面喷施是成本、时间消耗和劳动强度方面最有效的dsRNA传递方法之一。然而，关于SIGS作为可行的下一代作物保护方式，仍存在许多问题，尤其是田间环境中的完整植物是否能够吸收足够的喷洒dsRNA以发挥功效，以及所吸收的dsRNA是否能够系统性地传递进而影响难以获得的害虫和病原体。

RNAi的效率取决于向害虫/病原体输送足够的dsRNA或siRNA分子（图1）。在许多作物保护方案中，局部应用的完整dsRNA需要进入植物体内并系统地运输到远端植物组织（图1A，B）。植物体内的dsRNA的命运包括细胞摄取和加工成siRNA、移动到维管束和作为完整分子的系统运输，或降解。通过摄入长的dsRNA或某些情况下的siRNA，可以在昆虫中实现有效的RNAi效应。然而，害虫的保护是一个多方面的场景，其中饮食RNAi反应可能会受到取食行为、生命阶段和昆虫对植物的首选取食位点的影响。咀嚼式昆虫是SIGS方式进行防治的理想候选者，因为它们可以通过取食树叶轻松吸收大量局部应用的dsRNA。相比之下，该种方式对吸收式害虫的作用主要依赖于dsRNA在寄主植物维管束组织中的吸收和运动（图1C）。由于依赖高纤维素含量的食物而非活组织，专注性昆虫可能无法获得足够的dsRNA剂量，此外，它们还可以破坏植物的dsRNA运输系统。在某些情况下，dsRNAs可以直接喷洒在植物上的害虫上，因为dsRNAs可以穿透亚洲玉米螟、豌豆蚜和柠檬黄等物种的角质层。然而，dsRNA应用的传统角质层穿透途径并不适用于所有害虫；例如，有厚表皮的昆虫，如鞘翅目昆虫，或喜欢躲在无法喷洒的植物部位的昆虫。

图 1. 通过叶面dsRNA喷雾诱导RNAi实现作物保护

植物RNAi机制的一个重要特征是RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）能够促进的自扩增基因沉默效应。然而，在一些农业害虫中未发现活性RDRP，但在真菌等其他害虫中发现活性RDRP。此外，尽管siRNAs可以触发某些昆虫的RNAi效应，但据报道，很多昆虫（如西玉米根虫）的环境RNAi反应只能由长度超过50 bp的dsRNAs有效触发。这表明，植物系统内未加工的外源dsRNAs对于许多害虫成功进行基于RNAi的生物防治至关重要（图1B，C）。通过叶绿体转化，能够有效的克服dsRNA在植物中的加工剪切，从而可以提供足够的未加工dsRNA效应分子，以有效控制主要作物中的各种害虫，如WCR、棉铃虫和科罗拉多马铃薯甲虫。

最近的研究证实了RNAi通过跨界RNAi和环境RNAi抑制真菌生长和致病性的潜力。例如，来自植物表面的siRNA和长dsRNA可被灰霉病菌和镰刀菌物种吸收，并有效抑制真菌生长。一些研究也描述了宿主植物和真菌病原体之间小RNA的囊泡介导运输。然而，一些真菌病原体，Zymoseptoria tritici 和Colletotrichum gloeosporioides，由于不能吸收dsRNAs或siRNAs，即使它们具有功能性RNAi途径，也不能利用外源dsRNA。此外，一些真菌物种完全缺乏关键的RNAi成分，如Ustilago maydis 和 Saccharomyces cerevisiae，因此，它们不是合适的RNAi防治靶标物种。

尽管通过SIGS对各种害虫和病原体的RNAi效应进行了广泛的研究，但叶片dsRNA摄取和随后进入细胞的机制尚未得到充分的认识。了解这些机制对于大规模开发和优化基于RNAi的作物保护至关重要。为了实现显著的RNAi效应并有效控制害虫和病原体，喷洒的dsRNA必须在吸收之前克服叶片表面的几个障碍，然后转移到各个部分对植物进行系统保护。在某些情况下，如防止病毒病原体，细胞摄取和dsRNA处理至关重要（图1B）。

迄今为止，还没有证实叶片摄取dsRNA的具体途径，尽管气孔被建议作为切入点。一旦被吸收，植物的DCL可以在穿过质膜时将dsRNA部分加工成siRNA。然后，这些小RNA可以通过胞间连丝运输到相邻细胞，最有可能通过维管束运输到远端组织，或通过细胞外小泡运输到真菌病原体。另一方面，如果不经过处理或降解，dsRNA可以留在质外体中，并沿着质外体途径进入维管束进行远端易位（图1B）。由于各种生理、分子和环境因素可以限制局部RNAi的功效，因此更好地了解这些限制因素对于可持续叶面喷雾在作物保护中的应用至关重要。

在这篇综述中，讨论了目前关于叶面和细胞摄取dsRNA的知识，目的是确定有效RNAi的障碍，并提出今后改进dsRNA传递方法的方向。

2. 阻碍植物有效吸收dsRNA的环境因素

在进入植物之前，局部应用的dsRNA的持久性和稳定性会影响RNAi的效率。由于叶片对dsRNA的吸收不是一个直接的过程，因此dsRNA分子在叶片表面的较长保留时间可以提供稳定的dsRNA供应。dsRNAs在进入细胞之前的完整性也是与Dicer蛋白结合产生siRNAs所必需的。喷洒的dsRNA的持久性和稳定性会受到环境因素（如UV、热量和pH值）的显著影响，这会导致由于dsRNA在植物表面的降解而导致RNAi反应的变化（图2C）。此外，微生物等生物因素也可以通过核酸酶活性降低dsRNA的半衰期。

尽管RNA通常被认为在环境中不稳定，但有报道表明，与DNA相比，RNA具有更高的抗紫外线能力。然而，在暴露于紫外光下仅一小时后，观察到dsRNA的生物活性丧失，这可能是由于降解引起的。尽管如此，在野外条件下，紫外线如何影响dsRNA的稳定性和RNAi效率，还有进一步的证据。

另一个可能影响dsRNA降解的因素是pH值。在许多情况下，叶表面呈微酸性，但叶表面pH值存在种间差异。这种变异受叶片生理和环境中离子的影响，可能导致不同作物间的RNAi效率差异。由于其化学成分，RNA在酸性条件下比碱性条件下更稳定。尽管dsRNA可能在一定程度上抵抗碱性水解，但其精确机制和广泛适用性仍有待研究。鉴于以上几点，通过化学修饰或与稳定纳米颗粒的结合防止dsRNA在碱性中降解将大大有利于下游RNAi的应用。

在灌溉或降雨条件下，dsRNA的充足供应取决于在植物表面的保留。已证明，在马铃薯叶片上喷洒的dsRNA具有持久性，干燥后，不会明显被洗掉。相反，后来一项使用荧光染料和共焦显微镜的研究表明，裸dsRNA与加入BioClay LDH（层状双氢氧化物）复合物的dsRNA相比，很容易从烟叶中洗掉。在dsRNA叶面喷雾中使用表面活性剂或纳米颗粒（如LDH）可能会减少或防止灌溉或降雨造成的冲洗。另一种日益广泛使用的田间喷洒方法是使用无人机（UAV）系统，该系统利用气流将大量处理剂输送到叶片的背面。UAVs的实施在智能作物监测和农药管理中得到了广泛的应用，因为它可以提供精确的监测、大面积覆盖、及时的操作和优化的操作参数，这反过来又可以进一步提高杀虫剂的有效性。然而，目前还没有在田间条件下进行RNAi叶面喷施试验。

候选dsRNA叶片吸收途径和喷洒在叶片上的dsRNA分子吸收的物理障碍必须通过几个障碍才能进入植物系统。这些包括叶片的形态特征及其特性，以及叶片各部分与环境相互作用的方式，以及自然分泌（图2）。

2.1 叶片润湿性

植物表面对于防御各种生物和非生物胁迫因素至关重要。植物叶片表面形态也有助于叶片润湿性，即从露水、降雨、雾或灌溉中保持水分的能力。较低的叶片润湿性有利于防止病害的发生。叶片表面经常存在水分，为昆虫和真菌的生长提供了有利条件，使植物更容易受到疾病的影响。此外，高拒水性有助于清除叶片表面的灰尘或污染物等外来颗粒，防止它们升高叶片表面温度，抑制气孔关闭。包括角质层、角质层蜡和毛状体在内的特征在决定叶表面润湿性方面起着关键作用（图2A）。毛状体的存在增加了叶片表面的粗糙度，降低了叶片的润湿性（增加了疏水性），从而降低了叶片的吸水率。因为dsRNA分子被用作水性叶面喷雾，叶片润湿性在叶面喷雾液滴内的dsRNA沉积中起着至关重要的作用。同样，在叶面喷雾dsRNA穿透植物中也起着至关重要的作用。随着叶片润湿性的降低，作为局部喷雾剂的dsRNA更有可能在叶片表面形成珠状并滚落，穿透表面进入叶片内部的可能性较低。因此，叶片润湿性是叶片摄取dsRNA的第一道屏障，需要考虑这一屏障才能成功地进行SIGS。

图 2. 影响叶面和细胞吸收dsRNA的障碍概述

2.2 角质层和蜡

除了角质层在降低角质层蒸腾作用中的作用外，它还限制了叶片对农药、除草剂、营养素和生长因子的吸收。角质层的结构和组成可能因植物种类而异，但角质层的厚度通常保持在1到10μm之间。通常，角质层由不溶性聚合物角质基质和蜡组成。蜡由非极性可溶脂质组成，沉积在表皮表面（表皮蜡）或角质基质内（表皮内蜡）。除了通过增加对蒸汽流动的阻力来调节水分损失外，表皮蜡还负责形成一层疏水层，将水分从叶片表面排出。表皮蜡的另一个显著特征是在不同的环境条件下，不同植物物种的蜡晶体形状不同。例如，在柑橘类中观察到的板状物，云杉和银杏中的小枝，以及桉树中的颗粒状物。小麦等作物的形状多样性以及表皮蜡的厚度可以增强叶片吸收水分和溶质的物理屏障，也可能限制叶面对喷洒的dsRNA的吸收。

角质层的渗透性因植物种类和发育阶段而异。通常，角质层蜡的水和溶质渗透性随着温度的升高和有机溶质的大小的减小而增加。尽管假设胞间连丝仅限于植物组织内部，但在表皮细胞的外壁中也发现了胞间连丝。这些结构被称为外基质，为外部物质向组织内部的运输建立了通道。由于叶肉中存在亲水性酚类化合物、多糖、粘液细胞和水势梯度，叶片吸水（FWU）被认为是水分通过角质层水孔和外基质通过角质层的直接扩散。然而，在叶片中，外结皮层仍被角质层覆盖，这表明该途径的吸收仍将受到许多物理屏障的阻碍。或者，叶片的水分吸收也可能通过叶片结构发生，如气孔孔径、保卫细胞、毛状体、排水器或顶生粘液塞。目前，没有确凿的数据表明，由于大小限制（~ 1 nm），dsRNA分子是否可以通过水孔进入植物中。因此，可以合理地推测，喷洒的直径至少为3.2 nm、长度为100 nm（约300 bp）的dsRNA主要通过气孔、外基质或排水器等较大的开口进入植物。

2.3 气孔孔径

气孔孔径调节陆生植物的蒸腾作用和气体交换。由于气孔对植物生存和生长的重要性，人们对其进行了广泛的研究。最初，假设叶面施用溶液的渗透是通过气孔开口的质量流发生的。然而，气孔泛滥可能会限制气体交换，阻碍光合作用，使水溶液不太可能自发渗透。相反，溶质通过气孔的运输与水溶剂的渗透无关。研究表明，气孔允许溶质沿着保卫细胞表面进入，保卫细胞也受到毛状体和蜡对角质层表面润湿性的限制，从而使溶质远离保卫细胞。这一吸收过程虽然不适用于所有气孔，但被认为是由“反向蒸腾作用”促进的，在这个过程中，水蒸气通过气孔，将溶质带入叶片；因此，叶片表面和气孔上的水膜蒸发后的发生对于叶片吸收dsRNA是必要的。还应注意，气孔分布取决于物种和环境。在许多植物物种中，来自气孔的特殊结构，称为排水管，是通常在表皮或叶缘发现的不受调节的开口。据报道，除了它们的主要功能外，它们还参与叶片表面水分的吸收。尽管如此，缺乏证据表明这一发现是否适用于其他植物物种，这表明气孔开放可能是dsRNA进入叶片内部的主要途径。在农业环境中，田间喷洒是从上方进行的，近轴面上没有气孔也会阻碍叶面对喷洒的dsRNA的吸收。

3. 克服叶片吸收dsRNA障碍的可能方法  

由于气孔的解剖和理化特征，叶面应用的dsRNAs在叶片内部的吸收受到限制。通过增加叶片润湿性、增强角质层渗透和促进溶质运输，已经开发出潜在的方法来实现稳健的RNAi反应。这些方法包括通过磨损破坏角质层结构，使用高压或表面活性剂（表面活性剂），或化学修饰气孔孔径（图2D）。

表面活性剂与化学农药的结合已广泛用于植物病害管理。表面活性剂通常的添加，以降低叶片表面和液体之间的界面张力，并促进传播，从而使杀虫剂能够接触到顶部喷雾不易接触到的害虫目标。此外，表面活性剂还延长了化学喷雾在植物表面的停留时间，并增加了渗透性，以便吸收到植物或害虫中。然而，应仔细评估风险，以避免对植物、环境或偏离目标的生物体造成损害。

据报道，高压喷涂siRNAs可诱导烟草中GFP转基因的局部和系统沉默，而仅仅喷涂、注射器注射和siRNAs渗透都无法诱导RNAi。与此结果相反，最近的一项研究声称，高压喷洒dsRNA后，未观察到烟草中GFP基因的沉默。这项研究表明，植物细胞对dsRNA的摄取不足导致植物RNAi机制产生的siRNA不足，导致内源基因的RNAi效果不理想。这意味着，虽然dsRNA可能被导入到叶片中，但dsRNA不一定进入植物细胞。因此，还应考虑叶面吸收后细胞吸收喷洒dsRNA的障碍。

4. 叶面吸收后喷洒的dsRNA分子在植物体内的转运

在利用植物转化的研究中，已经报道了RNAi通过韧皮部的系统传播。当喷洒的dsRNA进入到叶片中并通过表皮扩散，然后扩散到叶肉时，有两种可能的情况：（i）dsRNA分子渗透到细胞壁，然后渗透到质膜，可能会或可能不会在细胞质中加工成小RNA，或者（ii）dsRNA没有被吸收到细胞质中，而是通过其他方式作为未加工的分子在整个植物中进行短距离或长距离的转运。有人认为，在穿过质膜后，dsRNA将被植物的RNAi机制部分加工成小RNA。这些小RNA很可能通过胞间连丝运输到相邻的细胞，然后运输到韧皮部，最后长距离运输到植物的其他部分。或者，不进入细胞质的dsRNA会通过质外体扩散到脉管系统进行远距离运输。小RNA被纳入细胞外小泡的可能性也被提出用于细胞间通信和植物-真菌相互作用。

对叶柄吸收或树干注射dsRNA的研究表明，荧光信号仅在苹果植株（Malus domestica）的木质部积累。这项研究推测，RNA分子（很可能是dsRNA）可能太大，无法运输到韧皮部细胞中。然而，还应注意，研究中叶柄对dsRNA的吸收可能导致木质部中dsRNA信号的积累。与此相反，其他研究成功地对韧皮部汁液中的siRNA进行了测序，而木质部被发现是无RNA的。据报道，外源应用的dsRNA的长距离易位，在未喷洒的大麦离体叶片远端观察到对镰刀菌的强烈抗性。这项研究提供的数据表明，dsRNA在维管束系统中的运动具有方向性，因此证明韧皮部是dsRNA运输的参与途径。推测，外源dsRNA首先进入质外体，然后通过一种尚不清楚的机制转移到木质部，然后转移到韧皮部。由于木质部到韧皮部的交换与质外体到木质部导管的物质外吞/内吞机制同时存在，因此不能排除这一假设。另一项研究表明，取食韧皮部的蚜虫基因被抑制，这表明未经加工的dsRNA从维管组织传递到昆虫。考虑到许多植物害虫都是以韧皮部为食的昆虫，长dsRNA是否能在韧皮部运输很重要，据报道，与以小RNA为食相比，许多害虫取食长dsRNA后，更容易产生RNAi效应。dsRNA的双向流动主要被认为与韧皮部运输有关，对于dsRNA向植物茎和根的目标病原体的易位也至关重要。喷施dsRNA在植物中的系统转运仍在积极研究中，因为转运和活性的潜在机制在很大程度上仍不清楚。

5. 细胞摄取dsRNA的障碍

喷洒的dsRNA绕过众多物理屏障并进入到叶片，dsRNA分子进入植物细胞仍面临更多障碍（图2）。所有的植物细胞都被包裹在由几个相互缠绕的生物聚合物形成的纤维素壁中，以支持和抵抗植物原生质体的膨胀压力。多孔细胞壁充当非特异性屏障，允许分子和离子成分从相邻细胞或细胞外环境进入质膜。由于其选择性原理，质膜是细胞摄取喷洒的dsRNA的主要屏障。

有人认为，细胞壁孔隙度可能会因发育阶段和细胞对环境的反应而发生变化。尽管细胞壁孔隙率限制了可以穿透细胞壁的分子的大小，但通常情况下，高达10纳米的大分子可以穿透细胞壁，而dsRNA的运输需要最小孔径为3.2纳米。最近的一项研究表明，dsDNA细胞摄取的极限大小在50到90 bp之间。然而，应该注意的是，这一说法是基于测量当时存在于受刺激内体中的dsDNA的数量。这可能是由于内吞作用后dsDNA的降解，或者是因为dsDNA的性质，虽然仍然依赖于序列，类似于dsRNA，但与dsRNA的性质截然不同。此外，一些研究表明外源dsRNA介导的抗植物病毒保护作用。这意味着外源应用的dsRNA被成功地吸收到植物细胞中，然后加工成siRNA以抑制病毒感染。

为了进入植物RNAi机制以产生小RNA，dsRNA需要进入细胞质。由于质膜由细胞壁的不同成分组成，因此质膜是限制细胞外颗粒进入的高度选择性屏障。细胞膜是一种带负电的脂质双层，含有跨膜通道和转运体。这些通道和转运体调节主动运输，以及小分子量物质跨膜扩散，但它们在dsRNA摄取中的作用尚不清楚。另一方面，内体的吞噬可能是细胞外颗粒的主要进入点。然而，触发dsRNA内吞的机制尚不清楚，因此进一步研究局部应用的dsRNA是否可以通过这种机制被植物细胞吸收是一个挑战。据报道，未受刺激的内体对内化的dsDNA无反应；因此，用转染试剂诱导内吞或与碳纳米载体结合可促进喷施植物中小RNA的高效产生。

6. 纳米载体可以作为一种有效的dsRNA传递方法

为了解决各种物理和生物化学障碍并提供保护，粒径范围为1至500 nm的纳米颗粒已被用于植物中的局部dsRNA传递（图2D）。带正电的纳米颗粒，包括但不限于金属或阳离子聚合物，旨在与dsRNA结合，形成可生物降解的复合物，以便随着时间的推移持续释放dsRNA。研究表明，含有纳米载体的配方可以保护dsRNA免受紫外线和核酸酶降解。纳米颗粒的使用还表明，冲洗后，喷洒在叶片表面的dsRNA的持久性增强了。这些方法表明，与层状双氢氧化物粘土纳米片（BioClay）复合的dsRNA大部分保留在叶子上，而未受保护的dsRNA很容易被洗掉。纳米颗粒的另一个有价值的方面是有可能改善叶面和细胞对喷洒的dsRNA的摄取。dsRNA纳米粒子复合物总体上带正电，因此可以增强通过带负电质膜的渗透性。即使在低压喷雾条件下，带有碳点的siRNA也能增强细胞的摄取，这表明植物的内源基因显著沉默。此外，已经研究了单壁碳纳米管（SWNT）将DNA和siRNA导入完整植物细胞的能力。单壁碳纳米管/DNA结合物的细胞摄取显示了将单壁碳纳米管用作不同植物细胞器的纳米转运体的潜力。最近的结果表明，SWNT可以保护siRNA免受核酸酶活性的影响，并有效地将DNA和siRNA传递到细胞质，触发内源性基因敲除。尽管关于纳米载体传递dsRNA的研究仍然有限，但这些结果表明，进一步改进纳米传递方法对于局部RNAi喷雾剂的实际应用具有重要意义。

7. 结束语

物理和生化障碍显著限制了外源dsRNA进入植物叶片组织。这些障碍为不同植物物种、靶点和环境设置之间局部RNAi效应的不一致性提供了可能的解释。叶片形态的种间差异也表明需要依赖于寄主的dsRNA传递方法，需要在选择局部RNAi的植物寄主和病原靶标后，逐个评估吸收效率。已经做出了一些努力来提高叶片对dsRNA的吸收，包括角质层磨损、高压喷雾、表面活性剂以及与纳米粒子的结合。尽管非常有效，但含有纳米颗粒的配方必须根据目标物种的具体情况进行设计，以避免环境风险。此外，纳米颗粒的使用还可以增强dsRNA在植物上的持久性，并在不受控制的环境中提供dsRNA的稳定性。dsRNA在植物内的运动和细胞对喷洒dsRNA的吸收对于针对特定植物疾病和提供系统保护至关重要。因此，开展更多的研究，将这些方法纳入作为叶面喷施的dsRNA传递设计中，对于在广阔领域内利用RNAi进行可持续作物保护的可行性至关重要。

原文链接：

https://doi.org/10.3390/ijms23126639