RNAi作物保护研究进展

RNAi技术是一种多功能、高效、安全、环保的农作物保护技术。大量证据表明，它可以通过宿主诱导基因沉默(HIGS)和喷雾诱导基因沉默(SIGS)技术来控制病毒、细菌、真菌、昆虫和线虫。

对于SIGS技术来说，其最大的挑战是稳定性，避免RNAi在环境中或在目标生物体吸收期间被过早降解。一种新的替代方法是以脂质体、病毒样颗粒、复合纳米颗粒和生物粘土为载体，通过载体中RNAi的重组生产、转基因和微/纳米胶囊来获得。所用材料应是安全的，可生物降解的，并且在多种化学环境中稳定，有利于RNAi的控制释放。目前对微囊化RNAi的研究主要集中在通过昆虫从口腔摄入微囊来沉默必需基因，进而控制昆虫这一方面。对RNAi技术的监管侧重于使用不同的方法进行风险评估，这种技术在农业的使用中，对于经济、环境和人类健康有着积极的作用。RNAi基因沉默与通过代谢调控诱导作物抗性相结合的替代方案有望在不久后问世，除此之外，多重沉默和大规模生产的生物技术优化也在开发中。

1. 引言

世界正在朝着更可持续的作物生产系统发展，该系统需要特定和有效的工具来对抗植物病原体。RNAi技术正可以用于这样的目的。

这种分子在自然界中使用后，降解迅速，可以在基因水平上破坏病原体，并可以丰富目前有机、常规、生态或技术生产的农艺作物保护实践方案。读者可能熟悉DNA和位于真核细胞细胞核中的基因的概念，其中包含创造有机分子的指令，主要是蛋白质。RNA在其中作为信使起到中介的作用，将细胞核的信息传递到细胞质，由核糖体读取以组装蛋白质。RNAi真核机制是一个复杂的病毒防御和基因表达调控系统，有时被称为转录后基因沉默(PTGS)。该系统可以由外部特定的dsRNA触发，导致信使RNA在到达核糖体之前被阻断。外部传递dsRNA进入体内，进而抑制表达系统，从植物到病原体之间是双向的，反之亦然。

因此，RNAi代表了一个机会，通过设计恰当的外部dsRNA来模拟或改善自然的植物病原菌调控系统。在此，我们旨在展示RNAi在作物保护方面的优势。基于植物的RNAi技术有两种：20世纪90年代以来的寄主诱导基因沉默(HIGS)和喷雾诱导基因沉默(SIGS)。两者都可以提供可持续的解决方案来控制病原体，如昆虫、病毒和真菌。我们将重点关注SIGS，因为它正在成为一种新兴的低成本的选择，每克的成本大约降低0.5-1美元；每公顷所需的dsRNA非常少，接近2-10克；它又是安全的，可以快速被环境降解。当dsRNA外部应用到植物上时，植物细胞可以携带它，通过在感染部位和胞间连丝中含有RNA的分泌囊泡释放出来，直接使用它来对付病原体。喷洒RNA的量可能会根据目标物种对RNAi的敏感性、触发防御系统的能力和传递方法的效率而有所不同。这项技术的其他挑战是，在现有的植物保护产品立法中，需要进行对局部RNAi应用进行以科学为基础的风险评估，以及使用一个以上的靶序列以避免耐药性的发生。

2. 作用机制

RNAi是在1998年发现的，注射双链RNA至秀丽隐杆线虫，可诱发基因沉默。这一发现在2006年获得了生理学和医学奖。注入的dsRNA最终敲除其他RNA的级联反应是复杂的。天然系统是microRNA，通过转录后基因沉默(PTGS)发挥作用，在需要时协调内部基因表达。它从RNApolII转录的基因组编码序列开始，产生第一个在细胞核中被几种酶处理的双链RNA，如DROSHA和Dgcr8，形成PremierRNA。该分子通过Exportin-5输出到细胞质，并在几种酶(解旋酶、DICER、TRBP和AGR-2 TNRC6)的帮助下，最终形成激活的RISC复合体，能够基于产生的RNA单链模板在遗传水平上抑制、破坏基因，甚至使基因失活。

不同寻常的是，RISC复合体是如何进化成能够使用外部dsRNA序列的防御系统，即短干扰RNA系统(SiRNA)。防御系统通常用于病毒防御。科学家们利用这种方法加入外部dsRNA来研究模式生物秀丽隐杆线虫的基因表达。当给予线虫长的dsRNA便会触发这个系统。第一种酶，Dicer酶，识别分子并将其切割成20-40个核苷酸的更小片段。然后，RISC复合体可以分离这些链，并用它们来沉默互补的信使RNA。真菌和植物可以产生dsRNA，在信息传递中相互破坏对方的防御系统。更令人着迷的是，植物可以将外部dsRNA从一个细胞移动到另一个细胞，并传递带有针对真菌的RNA的囊泡。

图 1.SIGS的作用机制

3. 潜在靶标

RNAi的潜在靶点可以是病毒、真菌、细菌、线虫和内源基因。接下来，我们描述一个包含几个目标的总表，证明该技术足够灵活，可以开始探索在其他疾病上的应用，如果读者感兴趣，还可以进行更广泛的筛查。在这些可能性中，我们想谈一谈使用SIGS生产新一代作物保护专用产品的潜力。

4. 改善封装技术以提高效率

封装技术的使用提高了通过指定的RNAi进行基因沉默的有效性。它为dsRNA提供保护和稳定性，防止它在运输到靶细胞时被酶或pH降解，在靶细胞中需要释放dsRNA并随后将其转化为siRNA。包埋系统的发展与靶标生物、传递的RNAi的类型及其摄取机制有关。根据这篇综述，更常见的是通过口服微囊dsRNA来控制昆虫，因为在肠道中具有碱性pH，并且在昆虫的消化道中存在RNase，这将降解裸露的RNAi。线虫也有类似的情况，不同的是它们肠道的pH值是酸性的。对植物和真菌的研究表明，它们可以接受dsRNA和siRNA。然而，在昆虫中，有人提出，与sRNA相比，使用长dsRNA(>50bp)时，沉默更有效，部分原因是其摄入机制的选择性。

利用不同的材料，如蛋白质、生物多聚体、粘土或脂类，可通过工程微生物或合成微/纳米颗粒来生产微囊化dsRNA。使用这些材料为siRNA整合到靶细胞中增添了宝贵的特性；例如，可被靶生物识别的衣壳蛋白利用自然感染机制促进dsRNAs渗透进入细胞。有多份报告表明，可运输和保护RNAi的封装工程系统适用于作物保护。

根据文献中提供的数据，我们确定了四种主要的包埋系统：脂质体、病毒样颗粒、复合纳米粒和生物粘土。如表2所述，这些系统在材料的生物降解性、提高RNAi稳定性的能力及其诱导调控的协同效应方面均具有优越性。

图 2.用于RNAi传递的初级封装系统

4.1 脂质体

脂质体是由胆固醇和无毒的天然磷脂合成的球形人工囊泡。它们具有亲水和疏水特性(两亲性分子)，便于它们在多种化学环境中相互作用。

疏水部分由两个脂肪酸链组成(10-24个碳原子，每个链上有0-6个双键)，而亲水性部分主要是一个与水溶性分子结合的磷酸。它们由至少一个磷脂层组成。脂质的类型决定了性质，如表面电荷、溶解度和囊泡的大小；因此，它对脂质体的功能至关重要。例如，不饱和磷脂酰胆碱形成渗透性更强但不太稳定的双层，而具有长酰基链的饱和磷脂形成更坚硬和防水的结构。根据它们的大小，它们被归类为非常小(0.025μm)或大(2.5μm)囊泡。

多种类型的脂类被用作原料，文献中最常见的是磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰胆碱(PC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DsPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二乙基磷酸盐、胆固醇(CH)硬脂胺或它们的混合物。

这种颗粒的一个优点是它的半渗透性类似于生物膜。由于它的细胞渗透能力，允许输送它携带的化合物。此外，它在亲水环境中的低溶解性有利于缓释机制，这有助于固定化合物并促进其在环境中的生物降解。然而，这项技术也有一些技术上的缺点，如磷脂的氧化和水解半衰期短，易受温度影响，以及其他与生产成本有关的问题。最常用的合成方法有注入法、电成型法、反相蒸发法、水合或薄膜水合、微流控、双乳液冷冻干燥、加热膜挤压、洗涤剂耗尽和超临界流体制备。这些方法的目的是获得具有可控和功能大小的稳定囊泡。

脂质体的应用非常广泛。例如，在人类和动物细胞中，它们可以作为药物输送系统，通过减少非靶组织的附带损害和过量剂量来治疗多种疾病。在食品科学中，它们用于保护和控制酶、维生素、功能化合物、抗生素和代谢物的输送，以改善食品的特性。在植物中，除了表2中关于RNAi传递的报告外，它们还被用作CRISPR/Cas基因编辑系统、蛋白质、DNA或mRNA的载体。此外，原生质体中的脂质体感染(脂质体介导的DNA传递)和营养物质的运输/内化也受到了关注。

4.2 病毒样颗粒(VLP)

病毒样颗粒(VLP)是指直径约为10-200 nm的蛋白质的自组装超分子，其结构与天然病毒粒子相同或相似。VLP不具传染性，因为它们缺乏具有传染性的遗传物质。除了作为纳米载体，VLP还可以通过在表面的特殊配基蛋白质实现功能化，表现出其他特性，如对化学环境变化的免疫和标记反应。

VLP可由异源表达系统产生，如杆状病毒、细菌、酵母、植物和动物细胞(昆虫、哺乳动物等)。要使用的表达载体必须根据所需蛋白质的类型和目标生物体来选择，因为表达产物可能取决于翻译后的修饰。根据病毒的类型，VLP可分为单链RNA正义病毒、单链RNA负义病毒、双链RNA病毒、单链和双链DNA病毒。此外，VLP可以在粗蛋白提取物(无细胞系统)中产生，主要是当异源表达产生对载体产生有毒的化合物时。此外，表达系统具有不同的产量，通常在病毒和细菌载体中更有效。VLP的表面偶联可以是共价的和非共价的；第一种选择是用大分子，甚至是完整的蛋白质来对VLP实现功能化。这种类型的结合通过噬菌体表达系统(MS2和Q-β)完成。

关于非共价结合，需要生物素化过程，这需要链霉亲和素等连接剂来确保大分子在VLP表面固定。

VLP的优点是自组装、重复结构稳定性好和由此产生的多分散系统。与裸分子相比，这提高了靶细胞的摄取效率。使用细胞识别蛋白降低了生物相互作用的难度。然而，它的生产也不能幸免于与媒介方面有关的限制，如系统复杂性、表达速度、效率、可伸缩性。

这项技术的主要应用是预防性疫苗；然而，其独特的特性使其可以作为纳米载体用于药物和基因治疗，作为生物成像的支架，并用于合成生物非肿瘤材料。关于它在植物和植物细胞中的用途，除了作为运输RNAi的载体外，它还被用于携带CRISPR/Cas复合体，作为一个无DNA的基因编辑系统。

4.3 复合纳米粒子

复合纳米颗粒是指遗传物质被包裹在聚合物颗粒中。所使用的聚合物是与带负电荷的核酸分子静电相互作用的聚阳离子。因此，电荷(磷酸二酯基)发生中和并在随后的胶体复合体中紧密结合。它还可以通过组分之间的氢键相互作用来稳定。聚合物的最终性能取决于原始聚合物的物理化学特性和由此产生的纳米颗粒特征：尺寸、表面电荷、多分散性和亲水性。

目前有大量可用于制造聚复合物的聚合物，最常用的聚合物包括聚乙二亚胺(PEI)、聚L-赖氨酸(PLL)、聚酰胺酯(PAE)、聚酰胺胺(PAMAM)、聚(2-二甲氨基甲基丙烯酸乙酯)(PDMAEMA)、聚乙二醇(PEg)和壳聚糖，以及诸如磷胆碱修饰的聚乙烯亚胺(PEI)、基于PEI的聚乙二醇(二甲基氨基甲基丙烯酸甲酯)、含叶酸的α、β-聚(N-3-羟丙基)-DL-天冬酰胺、基于半乳糖修饰的三甲基壳聚糖-半胱氨酸等。从理论上讲，任何带正电荷的聚合物都可以形成聚合物，特别是可生物降解的聚合物，如聚乙二醇、聚谷氨酸(PGA)、聚己内酯(PCL)、聚(D，L-丙交酯-乙交酯)(PLGA)、聚乳酸(PLA)、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酸酯共聚物(HPMA)、聚苯乙烯-马来酸酐共聚物。聚阳离子也可以通过开环聚合来合成，以控制所产生的电荷

聚合物的合成方法是多种多样的，由原料和用途决定。有一些很有价值的方法，如微流控装置支持的三维流体动力聚焦(3D-HF)技术。它尝试优化性能，提高系统的效率；传统方法可能已经成为一种限制，因为其中一些方法可能损害遗传物质的有机-水界面、剪切力或pH和温度水平。另一个限制是一些聚合物的生物相溶性和生物降解性降低，以及它们所存在的细胞毒性，需要生产衍生物来应对这些缺点。

复合纳米粒子是遗传物质的一种广泛使用的运输机制，因为它们设法阻止由胞外酶引起的遗传物质的降解，并准确地将负载定向到目标细胞，从而提高基因表达系统的有效性。纳米颗粒的摄取是通过内吞作用引起的，包括与细胞膜糖蛋白的相互作用和内小体的形成，然后将其释放到细胞质中，并进一步转移到目标器官。

它的主要应用是在基因治疗中作为DNA转移的非病毒载体，包括再生药物、艾滋病、癌症和遗传性疾病的治疗。它还被用于植物基因组的转基因和基因编辑，以及上述旨在控制病虫害的基因沉默系统。

4.4 生物粘土

生物粘土系统基于10-100 nm纳米粘土颗粒，能够运输选定的化合物，如核酸。纳米粘土是单层(0.70 nm厚)或双层(1 nm厚)的层状铝硅酸盐。单层(0.7 nm厚)或双层(1 nm厚)，具有可变的可塑性和膨胀性。其化学式为(Ca, Na, H) (Al, Mg, Fe, Zn)₂(Si,Al)₄O₁₀(OH)₂-xH₂O.。有天然材料和合成材料，它们的结构由交替的四面体SiO₂和八面体AlO₆片层以不同比例组成。

它的性质取决于表面原子的性质和层与层之间可交换的阳离子。粘土由于Al⁺³或Mg⁺²离子被硅取代而带负电荷。因此，由于Si-O共价键，纳米层的表面是疏水的；然而，可交换的亲水阳离子的添加可以将电荷改变为正。

最常用的原料有膨润土、海泡石、蒙脱石、高岭石、青铜矿、埃洛石、青铜矿、海泡石、皂石和蛭石。它们成本低，无毒，带电能力强。

对于生物粘土经常对其进行表面功能化以使其适应特定的应用。通过硅烷化等过程对粘土表面进行共价修饰来防止粘土聚集。例如，改性蒙脱土在聚合物的力学性能以及吸水率、阳离子交换和离子保持能力方面都有改善。其他粘土，如海泡石，由于其表面含有许多硅醇基团，通过连接有机硅烷使其功能化，使它们成为优秀的重金属清除剂。埃洛石主要通过与羟基缩合来共价连接有机硅烷以改变其性质。合成粘土，如Lapite®(由层状合成硅酸盐组成的层状硅酸盐)，从无机矿盐中获得，并通过离子交换或共价键改变表面性质。

它们的应用主要涉及材料科学、化学、物理和生物等领域，成为开发智能纳米建筑的战略材料。目前最多的用途是药物输送、环境修复、废水处理和食品包装。植物生物技术还被用于制造纳米复合材料，以改进材料的抗性，作为控制营养剂量的载体，并调节土壤性质；值得一提的是，通过液体纳米粘土将沙漠土壤转变为可耕种的农田。

5. 监管方式

与传统农药相比，获取生物分子(如dsRNA)登记数据的时间和成本较低，前者需要4年时间，后者需要12年时间，前者需要300-700万美元，后者需要280美元。一个重要的考虑是dsRNA在土壤、沉积物和水中通常具有较低的环境持久性。这种生物分子显示了从食物和缺乏口服免疫刺激的饮食中安全食用短和长RNA的记录。在过去十年中，围绕这项技术发生了积极的技术讨论，在这些讨论中，美国环保局和经济合作与发展组织(OECD)建议使用和调整现有的植物保护产品规范和程序，如下所述。

美国环境保护署(EPA)分析了如何根据人类健康和生态风险评估的问题使用这项技术。与此同时，经合组织建议利用风险评估来评估该分子的毒性概况和暴露情况，方法是调整目前的小分子农用化学品监管框架，作为基于dsRNA的农产品的一般框架，并建议考虑到通过审查基于dsRNA的转基因作物所获得的经验。EFSA关于转基因工厂的文献综述也是一份需要考虑的文件。

6. 结论和未来展望

RNAi技术是控制农作物病虫害的一种强大而通用的替代技术。它在农业领域的用途扩展到病毒、细菌、真菌、昆虫、线虫和植物。随着其他互补技术的发展，如载体中RNAi的重组生产、转基因和候选si/dsRNA的微/纳米胶囊，它的生产稳定。过去阻碍使用它的主要困难是生产成本和稳定性。随着新技术的发展，生产成本越来越低，而稳定性封装策略提供了避免降解的解决方案。

在过去的十年里，RNAi被包裹在脂质体、病毒样颗粒、复合纳米颗粒和生物粘土中，因为它们提供了防止降解的保护作用。在这项技术的发展过程中，提高其稳定性一直是一个挑战。由于环境暴露或酶的作用以及目标生物的pH水平，裸露的dsRNA很容易被降解。包膜为dsRNA提供了稳定性，有时也提高了细胞的摄取效率。一些用于包裹的材料可以为害虫防治提供了新的效果，同时，它们大多是无毒的、可生物降解的，并且在多种化学环境中稳定，有利于RNAi的控制释放。我们的综述发现许多关于这项技术的报道，主要应用于昆虫控制，其中主要的给药机制是基于SIGS的口服途径或封装在饵料中应用。

靶向沉默的候选基因主要是参与细胞分裂(如CDC27、gTub23C、TVX1、Cep89)、细胞运输(如Kif、αCOP)、结构形成(如ChSB、ACT-2、MEGF10、A5C)、离子平衡和营养吸收(如V-ATPase、vha26)的酶相关的必需基因，从而导致目标物种发生死亡。

目前对使用RNAi技术开发的产品的监管方法侧重于从不同的角度评估其风险。然而，基于这些生物分子的特性以及它们在非靶标生物中已被证明的安全性，这项技术在农业中的应用前景被预测为有利的，人们对其经济和环境优势以及与人类健康相关的低风险持乐观态度。监管环境可以允许在当前基于风险评估的决策中安全地采用这项技术。然而，不久将需要一种协调一致的方法，以实现采用和避免贸易中断。

除了有效的调控方法外，还希望出现更多跨学科的替代方案，与RNAi的基因沉默结合起来。例如，利用两种方法的长处，通过诱导和代谢调控方法提高作物的抗性。按照这种方法，我们正在开发一种技术，它使用由天然聚合物制成的纳米颗粒来诱导植物的抗性，它还将带有基于RNA i的双重调控机制，以提高植物针对镰刀菌属病原物种的抗性。科学家也有兴趣在相同的应用下进行多重敲除以提高植物针对病原体群体的抗性。这项技术的另一个挑战是不断降低生产成本，为此，生物技术正在成为大规模提高利润的主要方式之一。

原文链接：

https://doi.org/10.3390/ijms222212148

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