RNA 治疗剂生物分布的监管指南和临床前工具

Moderna 和Pfizer/BioNTech 基于信使 RNA 的 COVID-19 疫苗的成功标志着现代医学新篇章的开始。然而，mRNA 疗法的迅速兴起导致监管框架有些滞后。当前的指南要么不适用，要么不提及 RNA 疗法，要么没有被广泛接受的定义。这篇综述描述了 mRNA/siRNA 疗法的临床前生物分布研究指南，并强调了 mRNA 疫苗的相关差异。

现在，选择任何的治疗蛋白都可以几周内在 mRNA 水平编码后封装在脂质纳米颗粒 (LNP) 中，并得到临床前数据的支持。几个月内，mRNA COVID-19 疫苗在临床试验中进行了测试，并在一年内推向市场。COVID-19 大流行被欧洲药品管理局 (EMA) 和美国食品药品监督管理局 (FDA) 视为公共卫生紧急事件，因为目前疫苗的即时可用性超过了不太全面的制药和临床数据相关的风险授权。因此，SARS-CoV-2 疫苗在欧洲获得了有条件的上市许可，并在美国（US）获得了紧急使用许可。与这些批准相关的缩短时间与开发和授权新药的平均 10 年时间形成强烈对比。

在这篇综述中，“RNA 疗法”是指小干扰 RNA (siRNA) 和 mRNA。值得注意的是，根据 EMA 和 FDA的定义，针对传染病的预防性和治疗性疫苗目前不被视为“基因治疗药物产品”或“基因治疗产品”，。然而，疫苗和 RNA 治疗的指南在许多讨论点上是相似的。这篇综述描述了 RNA 疗法的生物分布研究指南，并强调了 mRNA 疫苗的相关差异。还讨论了体内 RNA 成像技术在满足和/或补充 FDA、EMA、国际协调委员会 (ICH) 发布的监管要求中的作用和国际药品监管机构计划 (IPRP) 。对于疫苗，EMA 参考了 WHO 指南，而 FDA 针对 COVID-19 大流行发布了自己的指南文件。因此，本 FDA 指导文件包含有关 mRNA 疫苗的最新指南，并将在大流行后进一步更新。此外，WHO以及可能的国家监管机构，如 EMA 和 FDA都期望新的 mRNA 特异性指南。所有生物分布指南都不具有约束力，通常不如毒理学研究等严格，但申请人应考虑可能适用其他具有约束力的国家和国际立法。

针对传染病的 mRNA 疫苗目前不被 EMA 和 FDA 等监管机构视为基因疗法。相反，尽管它们的组成和生产过程与蛋白质替代的 mRNA 疗法相同，但它们被视为疫苗。事实上，许多基于 mRNA 的疗法（包括 mRNA 疫苗）依赖重组 DNA 技术进行体外转录模板生产。基于这一特性，几乎所有基于 mRNA 的疗法都应归类为 EMA定义的“基因疗法药物”（值得注意的是，这不适用于基于 siRNA 的疗法，因为这些分子通常是化学制造的。此外，针对癌症等非传染性疾病的mRNA疫苗不被视为mRNA疫苗，而是基因治疗产品。引人注目的是，这意味着针对人乳头瘤病毒 (HPV) 诱导的恶性肿瘤的 mRNA 疫苗被归类为基因疗法，而使用相同的 mRNA 进行 HPV 疫苗接种则将其归类为疫苗。这种区别的基本原理（和含义）尚不清楚，但可能依赖于佐剂的附加作用和 mRNA 疫苗翻译的外源蛋白的抗原性质。尽管这些外源性蛋白质不太可能在体内具有生理功能，但这些疫苗旨在引发强大的持久免疫反应，因此在生物学上不是惰性的。此外，mRNA 疫苗的所有非 mRNA 成分的组织生物分布和脱靶相互作用与其他 (m)RNA 治疗剂相同。最后一点，基于病毒的 RNA 平台（例如自扩增或反式扩增 mRNA）编码包含病毒非结构蛋白的复制酶复合物和选择的治疗性蛋白。前者是外源性的，会引发类似疫苗的免疫反应，而后者在未来的应用中既可以是外源性的，也可以是内源性的。

生物分布研究旨在深入了解注射药物的下落。然后使用这些知识来帮助解释药物的药理学或毒理学相互作用。解释所有这些相互作用对于 mRNA 疗法来说是一项艰巨的任务，因为这些新型药物包含许多成分并在多个层次上进行处理。例如，聚乙二醇化的 LNP 可能会引发免疫反应，LNP 可以暂时使肝脏中的清除系统饱和，dsRNA 等杂质会引发促炎细胞因子的产生并导致细胞处于抗病毒状态，治疗性 mRNA 可以充当 miRNA 海绵，表达的治疗性蛋白可以在体内产生局部甚至远处的影响。此外，目前对 (m)RNA 疗法的临床前生物分布数据的规定含糊不清，没有具体说明，例如敏感性阈值。显然，扩大这种非常有前途的平台技术的临床应用和公众接受度将极大地受益于更强大的监管框架。随着申请临床批准的 (m)RNA 治疗药物数量迅速增加，从单一产品方法转向更通用的指南可能成为必要。

图 1. (m)RNA、蛋白质和 LNP 的常用标记和检测方法示意图。

生物分布研究被认为对 mRNA 疫苗不太重要，因为它们通常在皮肤或肌肉中局部给药。然而，肌肉内注射的荧光素酶 mRNA 也会在肝脏中产生发光。因此，mRNA-LNP 或其蛋白质产物是全身分布的，因此需要进行药代动力学研究，包括生物分布（图 1）。同样，生物分布研究对于（非疫苗）mRNA 疗法也不是严格强制的。随着基于 mRNA 的 CRISPR/Cas9 疗法的出现，这种观点应该重新考虑。此外，进行临床前生物分布研究可以通过优化其他强制性实验（例如毒理学）来节省时间、金钱和动物。

图 2. (a) 水、黑色素和氧合血红蛋白的吸收光谱。光学窗口中的吸收最小（（a）和（b）中的白色部分）。 (b) eGFP、miRFP、Cy7、萤火虫荧光素酶 (Fluc)、海肾荧光素酶 (hRluc) 和 NanoLuc (Nluc) 的发射光谱。

       定量全身放射自显影目前是大多数 RNA 生物分布研究的首选方法。该技术提供了药物分布的有价值的全身概览，同时仍保持组织水平的分辨率。然而，使用过的放射性物质需要专门的设施和训练有素的人员。此外，无法区分母体化合物及其代谢物/降解产物是一个相当大的限制，特别是对于不稳定的分子，如 RNA。最后，大多数标记的 RNA 永远不会进入细胞溶质，因此在解释毒理学发现时不一定相关。与小分子相比，这可能是新型RNA 疗法最重要的区别。因此，建议使用多模态成像和量化技术来充分评估 RNA 疗法的生物分布。例如，可以通过使用荧光素酶或荧光蛋白的mRNA编码序列来检查胞质mRNA的分布和翻译。来自同一动物的组织切片可用于通过杂交技术确定亚细胞 RNA 位置，并且（单细胞）RT-qPCR 可用于检测微量的 mRNA（图 2）。这些数据也可以与免疫组织化学结果相结合。或者, RNA 分子可以通过直接标记它们来可视化, 例如, 荧光胞嘧啶和细胞溶质 mRNA 传递可以用转基因 Ai14 报告小鼠进行评估。质谱法是一种强大的技术，用于量化完整和退化的siRNA，原位电离技术（例如，MALDI-FT-ICR-MS）将此信息与分布数据相结合。我们得出的结论是，这种快速发展的新型药物需要采用多层方法来充分了解其生物分布和体内特征。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.addr.2022.114236

https://mp.weixin.qq.com/s/WhrQDz7VYt8IAa9RHFTEig