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High Resolution Melting (HRM) analysis 在谱系地理学中的应用
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本人第一篇以第一作者发表的学术论文，刚刚公布于Molecular Ecology Resources的预览版上，谈的是 High Resolution Melting (HRM) analysis 这一工具可以在谱系地理学（phylogeography，或译作亲缘地理学/系统发生生物地理学）研究中用于检测未知的单倍型(haplotype)。（9月12日注：正式版已经发布在9月刊出的 Volume 12，Issue 5，pages 894-908页。）
所谓 High Resolution Melting (HRM) analysis，就是改进了的DNA熔解曲线分析。其原理就是DNA双链在加热过程中的解旋（熔解）动态与该DNA片段本身的长短及序列组成有关系。在实时（real-time）PCR 实验中，特异结合在DNA双链部分的荧光分子能够将这一解旋过程反映在最终的熔解曲线上，横坐标是温度，纵坐标是荧光强度（对应DNA双链部分的多少）。同一基因位点的两个不同等位基因，其序列差异往往会导致其熔解曲线的形状也有区别。这样，对于某段基因，虽然我们事先可能不知道两个生物个体之间是否存在变异，但通过实时PCR之后的熔解曲线测定，就能知道它们俩是否相同。同理，我们可以用它来检测每个种群内存在几种不同的等位基因（或单倍型）。目前为止还没有用于二倍体的核基因组，因为技术不够成熟。
在一个研究实例中，我们检测了石竹科的两个近缘种Arenaria ciliata 与 A. norvegica 在欧洲的一些种群，证实了这一方法能够在大批量DNA测序之前就确定出每个种群有几种单倍型。本方法的用处在于，仅需在HRM分析之后对部分样品测序，而不需对所有样品测序，就能知道所有样品的单倍型。当然，这种方法仍然是粗线条的，存在一定的漏检率，部分变异可能无法被熔解曲线反映出来。我们最后做了一点软件模拟实验，就是为了估计漏检率能有多少。唯一保险的做法是对所有样品进行测序，但相比而言，我们的方法能节省时间和金钱。而与传统的RFLP等方法相比，我们的方法能检测到更全面的遗传多态性信息，充分利用所有采集到的样品。
其实HRM这个技术早已经不是新鲜事物，在生物医学检测领域早已经用得很普遍了。我们只不过是把它搬过来用于另外一个领域而已。唯一的改进是把它用于更长的DNA片段。有些技术不新，不妙，也不保证完全准确，但是它们在实践中被证明很有用。这就是我们这篇文章的用意。各位做谱系地理学的同行，如果有条件使用 real-time PCR 仪器的，可以考虑尝试一下我们介绍的方法。论文摘要见下面的连接。
Rapid identification of chloroplast haplotypes using High Resolution Melting analysis
DOI: 10.1111/j.1755-0998.2012.03164.x
另外推荐一个在线工具uMeltSM,可以用来预测任意一段DNA序列的熔解曲线。开发这一工具的作者是 Zachary Dwight，其所在的研究组就是当初发明快速 real-time PCR 以及HRM 分析技术的 Carl T. Wittwer 在犹他大学的实验室。他们自己也仍然在做实时定量PCR仪器的开发与设计。
https://blog.sciencenet.cn/blog-351781-591522.html
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下一篇：Before making use of evolutionary theories
所谓 High Resolution Melting (HRM) analysis，就是改进了的DNA熔解曲线分析。其原理就是DNA双链在加热过程中的解旋（熔解）动态与该DNA片段本身的长短及序列组成有关系。在实时（real-time）PCR 实验中，特异结合在DNA双链部分的荧光分子能够将这一解旋过程反映在最终的熔解曲线上，横坐标是温度，纵坐标是荧光强度（对应DNA双链部分的多少）。同一基因位点的两个不同等位基因，其序列差异往往会导致其熔解曲线的形状也有区别。这样，对于某段基因，虽然我们事先可能不知道两个生物个体之间是否存在变异，但通过实时PCR之后的熔解曲线测定，就能知道它们俩是否相同。同理，我们可以用它来检测每个种群内存在几种不同的等位基因（或单倍型）。目前为止还没有用于二倍体的核基因组，因为技术不够成熟。
在一个研究实例中，我们检测了石竹科的两个近缘种Arenaria ciliata 与 A. norvegica 在欧洲的一些种群，证实了这一方法能够在大批量DNA测序之前就确定出每个种群有几种单倍型。本方法的用处在于，仅需在HRM分析之后对部分样品测序，而不需对所有样品测序，就能知道所有样品的单倍型。当然，这种方法仍然是粗线条的，存在一定的漏检率，部分变异可能无法被熔解曲线反映出来。我们最后做了一点软件模拟实验，就是为了估计漏检率能有多少。唯一保险的做法是对所有样品进行测序，但相比而言，我们的方法能节省时间和金钱。而与传统的RFLP等方法相比，我们的方法能检测到更全面的遗传多态性信息，充分利用所有采集到的样品。
其实HRM这个技术早已经不是新鲜事物，在生物医学检测领域早已经用得很普遍了。我们只不过是把它搬过来用于另外一个领域而已。唯一的改进是把它用于更长的DNA片段。有些技术不新，不妙，也不保证完全准确，但是它们在实践中被证明很有用。这就是我们这篇文章的用意。各位做谱系地理学的同行，如果有条件使用 real-time PCR 仪器的，可以考虑尝试一下我们介绍的方法。论文摘要见下面的连接。
Rapid identification of chloroplast haplotypes using High Resolution Melting analysis
DOI: 10.1111/j.1755-0998.2012.03164.x
另外推荐一个在线工具uMeltSM,可以用来预测任意一段DNA序列的熔解曲线。开发这一工具的作者是 Zachary Dwight，其所在的研究组就是当初发明快速 real-time PCR 以及HRM 分析技术的 Carl T. Wittwer 在犹他大学的实验室。他们自己也仍然在做实时定量PCR仪器的开发与设计。
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