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快速了解蛋白纯化原理
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快速了解蛋白纯化原理
蛋白纯化过程需要重组一个短的多肽标签（HIS，Flag，GST，HA，C-Myc，MBP等），然后再利用标签抗体进行纯化获得高纯度目标蛋白，便于进行后续生化实验研究。
His标签重组蛋白纯化
原理：固定金属离子亲和层析（IMAC）。组氨酸（His）的残基上带有1个咪唑基团，能够与过渡金属离子(Ni2+、Co2+、Cu2+等)形成配位键进行结合，这些金属离子能够用鳌合配体固定在层析介质上，因此带有His标签的蛋白经过层析介质时会被选择性的结合在介质上，而其他的杂质蛋白则不能结合或仅能微弱结合，在通过不同梯度咪唑竞争性洗脱得到较高纯度的 His 标签蛋白。总之，利用镍柱中金属离子可以与HIS标签的蛋白结合，在通过咪唑竞争性结合洗脱带有His标签的蛋白。
目前，Ni2+在亲和纯化实验中的使用最为广泛。根据结合基团的不同，Ni2+亲和层析柱可分为Ni-IDA和Ni-NTA。NTA的颗粒粒度均匀，粒径更小，并且螯合镍更稳定，能耐受较高的还原剂，使填料更加稳定，镍离子不易脱落，因此选择Ni-NTA亲和层析柱进行蛋白纯化。
His-tag优势：
1. His-Tag非常小，对蛋白的下游应用无影响
2. N-端的His-Tag与细菌的转录翻译机制兼容，有利于蛋白表达
3. 采用IMAC（固定化金属离子亲合层析）纯化His-Tag融合蛋白操作更加简便
4. His-Tag对目的蛋白本身特性几乎没有影响，不会形成二聚体
5. His-Tag的免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射入动物体内进行免疫并制备抗体
6. 与其它亲和标签构建成双亲和标签，并可应用于多种表达系统
Flag标签重组蛋白纯化
原理：FLAG标签重组蛋白纯化一般是利用亲和层析介质（FLAG抗体），磁珠法等进行纯化蛋白。FLAG 标签是为免疫亲和纯化特别设计的八个氨基酸残基（DYKDDDDK）序列内含一个肠激酶酶切位点，可以获得不含标签的高纯度蛋白。
Flag优势：
1. FLAG作为融合表达标签，其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能、性质。
2. 融合FLAG的目的蛋白，可以直接通过FLAG进行亲和层析，此层析为非变性纯化，可以纯化有活性的融合蛋白，并且纯化效率高。
3. FLAG作为标签蛋白能够FLAG抗体特异性识别。
4. 融合在N端的FLAG，其可以被肠激酶切除（DDDK），从而得到特异的目的蛋白。
GST标签重组蛋白纯化
原理：GST（谷胱甘肽S-转移酶）能特异的与其底物谷胱甘肽结合。
GST纯化系统其实就是凝胶亲和层析系统。利用凝胶手臂上的硫键结合一个谷胱甘肽。然后利用谷胱甘肽与谷胱甘肽巯基转移酶（即GST）之间酶和底物的特异性作用力，使得带GST标签的融合蛋白能够与凝胶上的手臂谷胱甘肽结合，从而将带标签的蛋白与其他蛋白分离开。
HA标签重组蛋白纯化
HA 标签（氨基酸序列：YPYDVPDYA）是一段来源于人流感病毒血凝素（HA）蛋白第 98～106 位氨基酸的短序列，分子量为 1.1 KDa，是目前广泛应用的表位标签之一，能形成强烈的抗体识别位点。通过分子生物学手段将 HA 标签融合到目的蛋白的 C 端或 N 端后，抗 HA 标签抗体可用于 HA 标记的靶蛋白的检测、分离和纯化，而无需蛋白特异性抗体或探针。
C-Myc标签重组蛋白纯化
Myc标签是一个具有11个氨基酸的短肽（序列为：EQKLISEEDL），1985年开发出鼠抗c-Myc抗体9E10并被作为免疫化学试剂用于细胞生物学和蛋白质工程领域中。抗体的11个氨基酸抗原表位表达在不同的蛋白质框架中仍可识别9E10免疫球蛋白。Myc标签可放在C端或N端，已成功应用在Western blot杂交技术、免疫沉淀和流式细胞术，因此可用于监测重组蛋白在细菌、酵母、昆虫细胞和哺乳细胞中的表达情况。Myc标签的蛋白可通过将9E10单克隆抗体偶联到固相介质上如琼脂糖凝胶或琼脂糖磁珠来进行亲和纯化，洗脱是采用低pH洗脱，但低pH往往会降低蛋白质的活力，所以Myc标签系统更广泛地应用于检测而较少用于纯化蛋白。
根据实验目的选择合适的标签，对后续实验很关键！！！！！！！！
参考：http://www.bio-linkedin.com/nd.jsp?id=88
http://www.bio-linkedin.com/nd.jsp?id=90
https://blog.sciencenet.cn/blog-3516886-1378439.html
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