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PP1 是一种有效的 Src 家族选择性酪氨酸激酶抑制剂 |MCE

已有 144 次阅读 2024-9-9 10:09 |系统分类:科研笔记

MCE 国际站：PP1

CAS：172889-26-8

品牌：MedChemExpress (MCE)

存储条件：Powder: -20°C, 3 years; 4°C, 2 years.In solvent: -80°C, 6 months; -20°C, 1 month.

生物活性：PP1 是一种有效的 Src 家族选择性酪氨酸激酶抑制剂，对 Lck 和 Fyn 的 IC₅₀ 分别为 5 和 6 nM。 IC50 和目标：IC50：5 nM (Lck)、6 nM (Fyn)、250 nM (EGFR)、>50 μM (JAK2)^[1]

激酶试验：将 Protein A-Sepharose 珠（制备为 50% (w/v) 悬浮液）以 250 μL/mL 添加到抗体/裂解物混合物中，并在 4°C 下孵育 30 分钟。然后将珠子在 1 mL 裂解缓冲液中洗涤两次，并在 1 mL 激酶缓冲液（25 mM HEPES、3 mM MnCl2、5 mM MgCl2 和 100 μM 原钒酸钠）中洗涤两次，并重悬至 50% (w/v)激酶缓冲液。将 25 微升珠悬浮液与适当浓度的化合物和 [γ-32P]ATP 一起添加到烯醇酶包被的 96 孔高蛋白结合板的每个孔中（25 μL/孔，200 μCi/mL激酶缓冲液中的溶液）。 20°C 孵育 20 分钟后，将 60 μL 含有 10 mM ATP 的沸腾 2× 溶解缓冲液添加到测定孔中以终止反应。从孔中取出 30 微升样品，煮沸 5 分钟，然后在 7.5% SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳。随后将凝胶干燥并暴露在柯达 X-AR 胶片上。为了定量，使用分子动力学激光扫描仪扫描薄膜，并确定主要底物带烯醇酶 p46 的光密度。引起烯醇酶磷酸化抑制 50% 的化合物浓度 (IC50) 由密度与化合物浓度的关系图确定。在测量化合物抗 Lck 活性的配套实验中，使用 50 mM EDTA、1 mM ATP 在 Skatron 收获机上对测定板进行两次洗涤循环洗涤。然后将闪烁液 (100 μL) 添加到孔中，并使用 Pharmacia Biotech micro-β 计数器测量磷的掺入。引起酶活性抑制 50% 的化合物浓度 (IC50) 由酶活性抑制百分比与化合物浓度的关系图确定[1]。

细胞试验：如下测量纯化的人外周血T细胞中抗CD3刺激的酪氨酸磷酸化的抑制。所有孵育均在 Eppendorf Thermomixer 5436 中于 37°C 下进行，混合设置为 11。将细胞（100 μL RPMI 1640 培养基中的 1×106）与药物一起孵育 15 分钟，然后与 1 孵育 6 分钟。 μg 抗 CD3/mL（抗 leu4，100 μg/mL）。反应的最终体积为 115 μL。通过添加 57.5 μL 3× 溶解缓冲液来终止反应，然后在添加之前在 100°C 下孵育。混合样品，煮沸 5 分钟，并储存在 -70°C 下。这些细胞裂解物的蛋白质印迹在 10% SDS 聚丙烯酰胺凝胶上进行，用多克隆抗磷酸酪氨酸抗体进行探测，并用 I 标记的蛋白 A (ICN) 检测免疫复合物。为了定量，使用分子动力学激光扫描仪扫描胶片，并在抗 CD3 存在（存在和不存在药物的情况下）对主要底物带 p70 的光密度进行定量。抑制百分比计算如下：(1-(存在药物时的p70光密度单位/不存在药物时的p70单位))×100。 IC50 等于测量到 50% 抑制时的化合物浓度[1]。

研究领域：Protein Tyrosine Kinase/RTK | Apoptosis

作用靶点：Src | Apoptosis

参考文献：[1]. Hanke JH, et al. Discovery of a novel, potent, and Src family-selective tyrosine kinase inhibitor. Study of Lck- and FynT-dependent T cell activation. J Biol Chem. 1996 Jan 12;271(2):695-701.