多细胞生物中，调节性细胞死亡过程 (RCD) 是细胞维持组织形态和功能必不可少的稳态机制。此前研究较多的调节性细胞死亡包括三大类：细胞凋亡、自噬和坏死。

“铁死亡”这一概念最早在 2012 年由 Dr. Brent R Stockwell 提出，它是一种铁离子依赖的新型细胞调节性死亡，在细胞形态学上，生化特征区别于细胞凋亡、坏死、自噬。从机制上简单来说，铁死亡是细胞膜上铁依赖性的高表达的不饱和脂肪酸，发生脂质过氧化，诱导的细胞死亡。

近年来，铁死亡相关研究是如火如荼，前途一片光明。今年 1 月，广州医科大学唐道林教授团队在 Nat Rev Clin Oncol 上发表题为 Broadening horizons: the role of ferroptosis in cancer 的综述。

图 1. 铁死亡在癌症中的作用^[1]

■ 外源性 (转运蛋白依赖) 途径

1、抑制胱氨酸/谷氨酸反向转运蛋白来促进铁死亡

■ 内源性 (酶调控) 途径

内源性途径是通过阻断细胞内抗氧化酶 (如 GPX4) 激活的。

1、抑制 GPX4 诱导铁死亡

脂质过氧化物积累是铁死亡的标志。GPX4 可将细胞毒性脂质过氧化物 (L-OOH) 还原为相应的醇 (L-OH)，抑制 GPX4 活性会导致细胞膜脂质过氧化物的积累。

直接抑制：如 RSL3 作为铁死亡诱导剂，可直接作用于 GPX4 并抑制其活性，因此降低了细胞的抗氧化能力并积累了 ROS，从而导致铁死亡。

2、其他酶的调节途径与脂肪酸积累

乙酰辅酶 A 羧化酶 (ACAC) 介导的脂肪酸合成，脂质吞噬 (Lipophagy) 介导的脂肪酸释放，可诱导细胞内游离脂肪酸的积累，促进铁死亡。

长链脂肪酸辅酶 A 连接酶 4 (ACSL4) 和溶血磷脂酰基转移酶 3 (LPCAT3) 促进多不饱和脂肪酸 (PUFA) 掺入磷脂中形成多不饱和脂肪酸的磷脂 (PUFA-PL)。PUFA-PLs 易受脂氧合酶 (ALOXs) 介导的自由基引发的氧化作用。这种氧化作用最终会导致脂质双层的破坏并影响膜功能，从而促进铁死亡。

上文介绍了铁死亡的基本途径。铁死亡有哪些研究策略呢？下面以文献 Energy-stress-mediated AMPK activation inhibits ferroptosis 为例。

作者团队建立了特定病理过程 (铁死亡) 的细胞模型，使用多种诱导剂和抑制剂，以及多种检测方法证明铁死亡与 AMPK 的调控关系，并建立了 AMPKα1/α2 的基因敲除细胞系 (AMPK DKO)，验证 AMPK 缺失对铁死亡敏感性的作用机制。

■ 确立铁死亡病理模型

1、能量应激 (Energy stress) 抑制铁死亡

首先，研究人员探索了永生化小鼠胚胎成纤维细胞 (MEFs) 中，葡萄糖饥饿条件对 Erastin 诱导的铁死亡的影响。首先，证明 Erastin 诱导铁死亡：Caspase-3 或 PARP 裂解均未下调 (细胞凋亡的标志)，而且铁死亡抑制剂 Ferrostatin-1 可以逆转 Erastin 诱导的细胞死亡。最初他们预想，葡萄糖饥饿的条件会增强  Erastin 诱导的铁死亡，结果恰恰相反：葡萄糖饥饿很大程度上逆转了 MEFs 中引起的铁死亡。

作者团队进一步选择了其他可诱导或模拟能量应激的化合物，包括 2-脱氧葡萄糖 (2-DG)、阿卡地新 (AICAR)、A769662。这些化合物也显著抑制了由 Erastin 处理引起的脂质过氧化和铁死亡。综上所述，能量应激抑制了铁死亡。

2、AMPKα1/α2 的基因敲除细胞系建立

3、AMPK 失活使癌细胞对铁死亡敏感

AMPK 在高基础 AMPK 磷酸化水平的癌细胞系中是否会促进铁死亡抗性？AMPK 抑制剂 Compound C 可下调 AMPK 的激活，如图 5a-b，Compound C 处理使 ACHN 细胞 (高基础 AMPK 磷酸化的抗铁碱化细胞系) 对 Erastin 或胱氨酸耗竭变敏感。透射电子显微镜 (TEM) 的结果也显示，ACHN 细胞中，Compound C 与 Erastin 或胱氨酸耗竭共同处理导致线粒体收缩，膜密度增加，但细胞核中没有明显的 DNA 片段化 (铁死亡的细胞特征形态特征)。这表明 AMPK 的抑制使癌细胞对铁死亡敏感。

图 5. Erastin 或胱氨酸耗竭条件下 ACHN 细胞对铁死亡的敏感性

(a-b. CCK8 法和脂质过氧化测定法检测，Erastin 或胱氨酸耗竭条件下 ACHN 细胞对铁死亡的敏感性；c. 透射电子显微镜 (TEM) 分析)

总结：

1、GSH-GPX4 抗氧化系统在铁死亡途径中起重要作用。脂质过氧化物增加，转铁蛋白等介导的铁的积累，以及细胞内游离脂肪酸的积累都可以诱导铁死亡。

2、Hyemin Lee 等人使用铁死亡通路相关的抑制剂/诱导剂，以及建立了 AMPK 敲除细胞系，证明铁死亡与 AMPK 之间的调节关系。

3、常见的检测铁死亡的实验方法：铁死亡相关细胞存活分析，如文中的 CCK8 法 (其他细胞活力检测方法还包括 MTT 法，台盼蓝染色等)。

4、除了细胞活力测定，脂质氧化水平的测定 (文中的 C11 BODIPY 581/591 染色)，GSH 测定，线粒体 ROS 测定，以及 GPX4 活性测定，电镜下线粒体的变化的监测，特异性靶标分子的分析 (WB、IHC、IF 等) 也是常用的检测手段。

相关产品

Erastin

铁死亡诱导剂，结合且抑制电压依赖性阴离子通道(VDAC2/VDAC3)。

RSL3

铁死亡诱导剂，可直接降低GPX4 的表达。

L-Cystine

一种氨基酸，在细胞调节过程中起着重要作用，胱氨酸耗竭会诱导铁死亡。

Ferrostatin-1

选择性的铁死亡抑制剂，人工合成的抗氧化剂，通过还原机制来防止膜脂的损伤，从而抑制细胞死亡。

AICAR

腺苷类似物，也是一种AMPK 激活剂，调节葡萄糖和脂质的代谢。

A-769662

有效的，可逆的AMPK 激活剂，EC50值为0.8 μM。

Compound C dihydrochloride

选择性AMPK 抑制剂，可参与细胞自噬以及铁死亡。

Thiazolyl Blue (MTT)

可用于细胞增殖，活性毒性的检测。

H2DCFDA

可渗透细胞的，用于检测细胞内活性氧(ROS) 水平的探针。

JC-1试剂盒

用于测量线粒体膜电位的荧光探针试剂盒。

TMRM Perchlorate

亲脂性红色荧光染料，可用于线粒体膜电位检测。

铁死亡化合物库

收集了500+ 种文献报道的具有诱导或抑制铁死亡相关的化合物及与铁死亡密切相关的靶点对应的化合物，可以用于铁死亡机制及相关疾病的研究。

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缩写

RCD: Regulated cell death

System xc-: The cystine/glutamate transporter

ACAC:Acetyl-CoA carboxylase

ACSL4：Acid-CoA ligase 4

GSH:Glutathione

GCL:Glutamate-cysteine ligase

GSS:Glutathione synthetase

Cys2：Cystine

GPX4:Glutathione peroxidase

TFRC:Iron-loaded serotransferrin-transferrin receptor

FTH1/FTL:Ferritin component

WB：Western Blot

IHC:Immunohistochemistry

IF:Immunofluorescence

参考文献

1. Daolin Tang, Xin Chen, Rui Kang, Guido Kroemer. Broadening horizons: the role of ferroptosis in cancer. Nat Rev Clin Oncol. 2021 Jan 29.

2. Hyemin Lee, et al. Energy-stress-mediated AMPK activation inhibits ferroptosis. Nat Cell Biol. 2020 Feb; 22(2): 225-234.

3. Jie Li, Feng Cao , He-Liang Yin, et al. Ferroptosis: past, present and future. Cell Death Dis. 2020 Feb 3;11(2):88.

4. Caicun Zhou, Xuefei Li, et al. Targeting ferroptosis for cancer therapy: exploring novel strategies from its mechanisms and role in cancers. Transl Lung Cancer Res. 2020 Aug;9(4):1569-1584.