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作者团队通过研究 p27+/+ MEFs 和 p27-/- MEFs 应对氨基酸剥夺后自噬的变化,证明了氨基酸缺乏的细胞中,p27 促进自噬。
细胞:
p27+/+ MEFs: p27 野生型 (p27+/+) 小鼠胚胎成纤维细胞 (MEFs),源于 p27 野生型小鼠胚胎。
p27+/+ MEFs: p27 缺失型 (p27-/-) MEFs,源于 p27 缺失的小鼠胚胎。
2、p27 调控自噬流的检测
自噬是一个多步骤的动态过程,当应答营养匮乏的压力时 (如氨基酸或葡萄糖缺乏),细胞接受自噬诱导信号,随后会在胞浆处形成一种扁平的叫做吞噬泡 (Phagophore) 的双层膜结构。紧接着,吞噬泡不断延伸,包裹一些细胞元件或者自噬物 (Autophagic cargo),形成密闭的球状的自噬小体 (Autophagosome)。自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体 (Autolysosome),自噬体中的内容物被溶酶体中的酶降解,降解产生的营养物质会被细胞重新利用。
在整个过程中,细胞将自噬物吞噬到自噬小体,直到最后自噬溶酶体形成并降解自噬物的这个过程被称为自噬流 (Autophagic flux) (图 3)。自噬流中的任一环节出现障碍自噬都无法完成其生物学功能。
如果 LC3B-II 表达增加,可能是由于前期自噬活化后自噬小体增多导致的,也可能是后期自噬溶酶体清除失败使其积累所致。因此,某单一时间点的 LC3B-II 的表达改变并不能体现自噬流的改变。
在文章中,使用了 WB 检测蛋白、免疫荧光,mCherry-eGFP-LC3B 双荧光系统的组合测量方法,检测 p27+/+ 和 p27-/- MEFs 自噬流。
【a-b: p27+/+ 和 p27-/- MEFs 中,aa-剥夺 0 h、1 h、4 h 后 (有或无氯喹处理) , LC3B-II 的表达和不同细胞中自噬流变化的定量分析 (LC3B-II+CQ/actin)/(LC3B-II-CQ/actin);c-d: aa-剥夺 0 h、48 h 后,LC3B-II 的表达和自噬流变化的定量分析】
(2) p62/SQSTM1 在细胞中的积累
p62 也称为 SQSTM1 蛋白,作为一种调节因子参与自噬体的构成,具有底物的特异性,是连接 LC3B-II 与待降解泛素化底物的桥梁。p62 结合泛素化蛋白进入到自噬体后最终与溶酶体融合形成自噬溶酶体从而得到清除 (图 5a)。自噬流被抑制时,p62/SQSTM1 会在自噬流受损的细胞中积累, 在细胞内整体 p62 水平的表达与自噬活性存在负相关。
如图 5 b 所示,随着时间的增长,p62 在氨基酸缺乏的 p27-/- 细胞中的表达量更高,p27-/- 细胞的自噬流受损,这进一步说明了,p27 可以促进自噬流活化。
图 6. 串联荧光探针及荧光共定位检测自噬流
【a: mCherry-eGFP-LC3B 串联荧光探针示意图与机制[6];b: p27+/+ 和p27-/- MEFs 中,0 h 或 aa-剥夺 48 h 时,mCherry-eGFP-LC3B 示踪自噬体以及与自噬溶酶体形成;c: 自噬小体 (黄色) 和自噬溶酶体 (红色) 的定量分析】
如图 6a-b,mCherry 荧光基团的 pH 值稳定性比 GFP 高,GFP 荧光信号在进入溶酶体后由于 pH 值的下降会出现淬灭,而 mCherry 荧光基团进入溶酶体后仍能发出荧光。因此若细胞内出现绿和红色荧光共定位,即出现黄色荧光时,表明:mCherry-eGFP-LC3B 融合蛋白并未与溶酶体发生融合, 说明了自噬流被阻断。当细胞内仅出现红色荧光而无绿色荧光时,代表 mCherry-eGFP-LC3B 融合蛋白定位于溶酶体或自噬溶酶体内,即自噬流活化。
(4) p27 促进自噬体成熟
图 7. p27 促进自噬体成熟过程的中间体形成
【a: p27+/+ 和 p27-/- MEFs 中,0 h 或 aa-剥夺 48 h 时, LC3B 和 p62 的免疫染色 (虚线描绘了 LC3B 阳性环状结构);b: p27+/+ 和p27-/- MEFs 中 LC3B 环状聚集物的定量。】
之前有文献表明 (参考文献 5),自噬体在成熟过程中,LC3B 阳性自噬囊泡会聚集在细胞核周围形成环状聚集结构,这种结构被认为是自噬体成熟过程中的中间结构。如图 7a 所示,p27+/+ 细胞中有明显的环状聚集体,但是在 p27-/- 细胞中很少观察到,取而代之的是小囊泡结构。这表明 p27 可促进自噬体成熟过程。
1、在长期氨基酸剥夺的情况下,与 p27-/- 细胞相比,p27+/+ 小鼠胚胎成纤维细胞中 LC3B-II 的上调,p62 蛋白表达量减少,自噬溶酶体数目比例增加,以及自噬体成熟过程环状聚集体的形成,可以证明 p27 在氨基酸长期匮乏的细胞中促进自噬流活化。
2、自噬流在细胞内是流动的细胞代谢过程, 自噬流中的任一环节出现障碍自噬将无法完成其生物学功能。尚无某种单一方法可以绝对准确特异的检测自噬,因此应该使用组合的实验方法来评估自噬活动 (自噬相关工具药物的使用,WB 检测自噬相关蛋白变化,免疫荧光共定位,以及 mCherry-eGFP-LC3B 双荧光检测等)。
原文链接:DOI: 10.1038/s41556-020-0554-4.
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参考文献
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Human Diseases. Front Cell Dev Biol. 2019 Mar 19; 7: 38.
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