图3 卫星拍摄的海面生物发光现象，蓝发光斑块有近300km长，其覆盖面积相当于夏威夷群岛[4, 9]。

2 生物发光的生理与生态功能

生物发光现象具有重要的生物学意义，生物发光以其独特性，对研究海洋生态系统、生物生理生化反应和新技术的开发都具有重要的价值。

不同物种的生物发光，有着几乎迥异的发光机理和基因背景，这反映了生物发光在进化上的多源性和遗传多样性。动物发光是受到神经调控的。动物不仅可以调控发射光的开与关，还可以调控发光素的浓度、颜色甚至分布。这些调控的过程常常需要钙离子（Ca2+）和其他神经递质的参与。在一些鞭毛藻类中，光的发射调控源自于细胞膜表面的压力刺激，还包含了一系列下游一系列信号分子的参与，信号传递的过程相当迅速[16]。细菌发光机理与动植物均不同，底物在催化循环中会形成还原型核黄素磷酸盐和醛化合物，当遇到荧光素酶和氧时，就会形成一种处于激发态的化合物。络合物断裂时生成氧化核黄素磷酸盐、酸、水及一个光子，波长470～505nm，光为蓝绿色[17]。

鞭毛藻类的发光具有一定的周期节律性，例如夜间发光更为明亮或是仅于夜间发光。这可能是因为荧光素的氧化还原存在日夜的周期性[18]。其他一些生活在明亮环境中的发光生物，光照可能导致发光素的降解，所以需要一段黑暗的时间的准备与积累才能发光[19]。由于生物发光本身的复杂性和多样性，目前仍有相当一部分的物种，其发光机理未能被研究清楚。

进入海水的光线会以每75米降低10倍的速度减弱，在海洋深处1000米处，所有的可见光几乎完全消失[20]。黑暗环境中，生物发光是远距离通讯的有效手段。在某些条件下，一个生物的光闪烁，甚至可以在几百米外被看到[14,21]。甚至一个只有0.5mm大小的单细胞鞭毛藻发出的光，也能被5m远的鱼看见。相当于一个2m高的人与20km以外的人沟通。光信号与化学信号、声音信号不同，最重要的特点是其具有相对准确的方向性，且在没有听觉或发声系统的藻类中，有着极为重要的作用。这可能是低等藻类与高等鱼类通讯的一种有效方式[22]。

对于生物来说，海洋是毫无藏身之处的地方，因此，许多生物为了安全，白天迁移到无光的深海，夜里才游到靠近海面食物丰富处觅食[4]。（4）在这样一个昏暗的环境里，进化出发光的能力可以说是一种竞争优势：（1）发光可以帮助动物发现与定位食物；（2）通过种属特异性的发光方式来吸引配偶；（3）可以作为防御的能力。如一些甲壳类、章鱼、水母等，在遇到捕食者时会将发光物质排放到水中，产生云雾状的荧光颗粒来分散捕食者的注意力。从而得到逃脱的机会。发光栉水母的防护方式更为另类,它以一种被称为“牺牲标签”的保护光作为防御，当栉水母被捕食者吞食后，会引起某些半透明捕食者身体发出光芒，这种光芒会使捕食者暴露，从而被更高级的捕食者捕食。因此，这种光对于捕食者来说是非常危险 [4]。

在生存竞争中，自然选择的压力使得生物发光与感光的能力不断进化。甚至还有一些鱼类、甲壳类动物以及鱿鱼等进化出一种“反照明”发光能力。它们可以调整自己的发光亮度以适应周围的光线，这样就可以隐去自己的身影以躲避捕食者的攻击[4]。

生存竞争和自然选择使得生物发光的多样性不断增加，就形成了今天这样一个生机勃勃，五光十色的海底世界。

3 生物发光的研究历程

“生物发光”现象是一个吸引人们数千年的问题，同时也是生物界最让人匪夷所思的现象之一。在科学家们不断的努力和探索中，生物发光的秘密一点点地被破解，其研究历史也是充满了传奇色彩。

从亚里士多德（Aristotle）的年代起，就有很多科学家对生物发光现象作出了描述和分析。生物放光研究的转折点是著名的Dubois实验[23]。1887年，生理学教授Raphael Dubois发现，一种叫做Pyrophorus的甲虫，死后腐烂的尸体仍然可以发光。于是他把死亡虫体混合物放入冷水中，发现发光先增强，后减弱；若把混合物放入热水中，则不会发光，即使再冷却也不会再发光。如果将冷却的热水混合物和冷水混合物再混合，又能重新发光。于是，他得出两个重要的结论，一是生物发光需要两种重要的组分；两种组分中，用于发光的燃料即荧光素(luciferin)是耐热的，而发光引发剂即荧光素酶（luciferase）是不耐热的。发光的机理是，由荧光酶作为酶催化底物分子荧光素，经过化学反应后产生荧光。这个实验开创了生物发光研究的先河，也是早期“荧光素-荧光素酶”理论体系的基础。

1935年，生物发光研究的鼻祖之一Edund Newton Harvey，领导他的团队从水母混合物中分离浓缩出Cypridina荧光素[24] ，但是这种荧光素的纯度仍然没有达到能用于结晶的标准，于是探索荧光素的化学性质和作用机理的研究又一次停滞。直到1957年，日裔美国海洋生物学家Osamu Shimomura分离纯化并结晶出了Cypridina荧光素[25]，树立了荧光素结构与功能研究的里程碑。他的工作被Harvey的学生Frank H. Johnson关注，并邀请Shimomura开始了他们具有划时代意义的合作。

1961年，一次偶然的机会，Shimomura发现他倒入洗手池的水母素粉末竟然在残留海水的作用下恢复了荧光。这提示了他们钙离子可能对水母素的发光有至关重要的作用。很快，他们发现了水母素（aequorin）钙依赖的荧光发射体系，证明了钙离子能增强水母素的荧光。1963年，他们在《科学》杂志报道了钙和水母素发光的关系[26]。

4 绿色荧光蛋白的问世

水母素是荧光酶的一种，它需荧光素才能发光，也就是所谓的“荧光素-荧光素酶”双组份体系。而出人意料的是，在发现水母素的同时，还发现了一种物质，Shimomura和Johnson发表纯化水母素的文章中，有这样一个脚注：“发现了另一种蛋白，它在阳光下呈现绿色、钨丝下呈现黄色、紫外光下发射强烈绿色。[26]”其后他们仔细研究了其发光特性。1974年，他们得到了这个蛋白，这便是后来对生物学界研究有重大贡献的绿色荧光蛋白（GFP），也就是2008年诺贝尔化学奖的主角。Shimomura等人进一步研究表明，水母产生的绿色荧光源于一个能量传递过程，在此过程中，水母素激发GFP然后发出绿光。绿色荧光蛋白的发光机理与水母素不同，它的发光是一个单组分的物理过程，电子被激发光激发从单线态第一激发态返回到基态时释放出的光，就是荧光。

至此，这个在地球上沉睡了一亿六千万年的神奇荧光蛋白终于浮出海洋；谁又能想到，它后来居然还能钻进其它生物的细胞，并帮助人类照亮了周围那些本不可见的世界。

但是，当时的Shimomura对GFP的应用前景不敏感，也未意识到应用的重要性。他离开后，他的同事Douglas Prasher非常感兴趣用荧光蛋白做生物示踪分子。1985年，Prasher和日裔科学家Satoshi Inouye分别根据蛋白质序列得到了水母素的基因。1992年，Prasher得到了GFP的基因。可是，科学发展总是充满了坎坷，普瑞舍在1992年发表GFP基因的文章后，又由于不能得到美国国家科学基金委员会的认可，一怒之下就从此离开了科学界。

1994，Martin Chalfie及其合作者证明GFP能够在Aequorea victoria以外的生物中表达，比如大肠杆菌和小秀丽线虫[27]。这一突破为GFP作为荧光标签在生物活动研究中的实际应用铺平了道路。这一结果证明，GFP不需要其它辅助试剂或辅助蛋白的参与就能产生荧光，这就意味着GFP可被用作一个通用标签，来标记蛋白质，便于人们对蛋白质定位，相互作用的研究。

Chalfie的文章立即引起轰动。1994年之后，GFP的应用研究论文的发表量呈指数增长。对GFP的改造和新型荧光蛋白的开发工作，从此没有停止：绿色荧光蛋白又被用到了病毒、酵母、小鼠、植物甚至人类等各种生物。

     2008年的诺贝尔化学奖就是为了表彰绿色荧光蛋白的工作，诺贝奖评奖委员会成员在评论绿色荧光蛋白的功绩时说，它“照亮了生物学研究的未来” 。

5 科学界的彩虹

野生型GFP存在一些弊端，比如荧光强度不够高，漂白速度较快，激发光为高能量的紫外线，这就使得观察的过程不可避免地对细胞造成了损害。基于改造野生型GFP的想法，钱永健（Roger Yonchien Tsien）的团队做出了一系列贡献，使得荧光蛋白的应用范围已经得到大大拓宽。钱永健是第一位致力于改造绿色荧光蛋白的人，世界上目前使用的荧光蛋白大多是钱永健实验室改造后的变种。

GFP的进一步发展是基于对这种蛋白质分子结构及其发色团的充分了解。钱永健及其合作者解释了GFP肽链中65位的丝氨酸（serine）、66位的酪氨酸（tyrosine）和67位的甘氨酸（glycine）在氧存在条件下如何发生反应形成三肽环形荧光发色团对羟基苯咪唑啉酮[28] （p-hydroxybenzylideneimidazolinone）。发射峰在505nm附近达到高峰。在此基础上，钱永健进一步发展出了其它的GFP衍生物，这些衍生物具有不同光谱特性并且稳定性得以提高。

钱永健利用随机突变的方法，将GFP中发色团的关键氨基酸进行突变。他们筛选了大约6000个突变体克隆，最终获得了蓝色荧光蛋白（BFP），这个突变体是由组氨酸替代了GFP第66位的酪氨酸[28]。

为了获得一个高且窄的单一吸收峰，同时希望吸收峰能尽量偏向于长波长，发射峰尽可能高也就是荧光强度尽可能强。钱永健的团队又进行了一番探索。一年之后，他们的筛选成果发表在自然杂志上：他们获得了一个由苏氨酸替代65位色氨酸的突变体，这个突变体在490nm有单一、高且窄的吸收峰，它的荧光发射峰值是野生型GFP的8倍[29]。

如上文提到的，钱永健的团队先后改造出了荧光蛋白的蓝色系列、青色系列、黄色系列、橙色系列的荧光蛋白。Matz等人从珊瑚中分离出红色荧光蛋白基因（“DsRed”）[30]。再后来，科学家利用从海葵中分离的荧光蛋白衍生出的红粉系列的蛋白，并将其以水果的名字命名[31]。在过去几年发展起来的荧光蛋白变体，其荧光激发谱几乎覆盖了整个可见光的光谱范围。发色团周围环境的变化，如带电氨基酸残基的位置、氢键网络及蛋白间疏水作用等可能产生蓝色或红色光谱漂移。科学家们进一步研究荧光蛋白发色团的复杂特性，找到了关于多肽骨架结构与功能关系的线索。借助基因工程手段可以更精细地调整颜色变体，以扩大荧光蛋白的光谱范围。至此，荧光蛋白终于能在细胞中画出一道完整的彩虹[32]（图4）。

让蛋白质带有不同颜色的荧光，这可不仅仅是为了色彩丰富那么浪漫的目的。不同颜色的荧光代表不同的蛋白质分子，只要两种荧光蛋白的谱线轮廓不同且没有重叠，就可以同时用作报告基因并共同显色，用于体内双标记或荧光能量转移分析（Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET）等研究，例如增强型绿色荧光蛋白（EGFP）和增强型黄色荧光蛋白（EYFP）。GFP及其颜色变体作为报告蛋白的应用为科学研究提供了一个空前的高精度检测方法，有着广阔的应用前景。

                                                 图4 利用表达荧光蛋白菌液绘出的图画[32]

6 点亮生命的启示

1900年，巴黎国际博览会（the Paris International Exposition）上，Dubois用6瓶装有发光细菌照亮了整个房间，进入房间的人，甚至还可以用这样的光线看报纸[23]。20世纪40年代，日本海军利用Cypridina的干粉作为照明的工具，可以在不被敌军发现的情况下指示队友的位置或阅读地图[23]。这些利用发光生物作为光源的尝试，虽说没有广泛被市场所认可，但却有其独特的优势。不知道在能源稀缺的今天，发光生物的应用是否会再次被“点燃”呢？

随着绿色荧光蛋白的问世，GFP融合蛋白技术被广泛应用于蛋白质的定位、筛选和相互作用的研究，为生命科学供了强有力的研究手段。荧光蛋白能够在活体细胞、组织和甚至整体生物体内进行动态、微量、直观的检测，是21世纪应用最广泛、最灵敏、最重要的生物技术，也是现代功能成像和分子成像技术的基础。目前，荧光蛋白的应用已经广泛深入到各个学科领域中，极大地推动了世界医学和生命科学的发展。

GFP融合蛋白技术就是通过GFP荧光信号来监测与其融合表达的目标蛋白的定位、动态变化、化学反应和蛋白质之间的相互作用。GFP作为荧光示踪“标签”，将科学家要研究的蛋白“点亮”，使得蛋白的行为可以在体内体外得到实时的监测。这种技术在细胞内参数的测定、基因的时序表达、细胞内组织成像中都发挥了重要作用。

如上文提到的，当两种荧光蛋白融合蛋白，一种发射光谱波长与另一种的激发光谱重叠，就会产生荧光共振转移，并发出较强的FRET信号。这就是荧光蛋白在研究蛋白质相互作用中的基本原理。研究这种直接相互作用的另一种方法是通过GFP蛋白的互补。一种蛋白与GFP的一部分融合，同时另一种蛋白与GFP的另一半融合。当两种蛋白形成复合体，GFP的两部分会结合在一起从而产生荧光。

荧光蛋白除了有各种颜色的变体之外，还有具有其他性质的如热稳定荧光蛋白[33]，光激发蛋白[34]，和光转化蛋白[35]。都是新兴的开发热点。光激活荧光蛋白可以在近紫外光的激发下，由非荧光状态转化为荧光状态；而光转化荧光蛋白则可以被激发由一种颜色的荧光转化为另一种颜色的荧光。

荧光蛋白技术已经发展十分迅速，前景也很广阔。但由于其肽段可能会对一些都具体蛋白的组装造成影响，因此，最新的科研正致力于荧光小分子的开发。如：香豆素(coumarins)，荧光素(fluoresceins)，花青素(cyanines)，BODIPY染料(bodipy dyes)）等等[36]。这些荧光分子提供了多样的光学性能包括摩尔吸收值，量子产率，Stokes位移，光漂泊速率以及对于环境的敏感性。为蛋白质的标记和示踪提供了更多有力的工具。

综上所述，绿色荧光蛋白及其变体的开发及应用取得了惊人的成果，可以说是“点亮了生命”，“点亮了未来”。

致谢：

此工作由国家自然科学基金委项目（30870592，90913022）支持。

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The Interesting Bioluminescent Creatures and the Amazing Fluorescent Proteins.

Abstract:

Although bioluminescence seems to be mysterious, it is common in nature with important ecological functions and evolutionary meanings.  From using bioluminescent plant as light, to applying green fluorescent proteins as protein expression markers in cells; from researches on the mechanism of bioluminescence, to the developments of new types of fluorescent proteins – the  secrets of life is lighting up.

Key words: Bioluminescence, Fluorescent proteins,