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FlowJo分析钙离子流量
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FlowJo分析钙离子流量
作者：蔡何青，FlowJo 技术专员
一、原理
钙离子是机体的重要元素，同时作为细胞内第二信使通过与钙调蛋白（Calmodulin，CaM）结合激活多种蛋白激酶（如腺苷酸环化酶、磷酸二酯酶、钙调蛋白激酶等）及诸多蛋白水解酶和核酸酶，从而参与包括细胞代谢、细胞周期等多种细胞功能的调节，在细胞的许多生命活动中担当着重要的角色。因此，钙离子测定在医学实验研究中有着重要意义。
钙离子流量可以用多种实验方法监测，其中流式细胞技术监测钙离子是一种简单方便准确的方法，得到了很多应用。实验中，需要分析细胞内钙离子含量随时间变化的曲线。在流式采集的过程中，需要采集“Time”参数，在开始的1~2分钟内采集未刺激细胞的钙离子含量数据，然后加入刺激并采集刺激后的数据。实验的目的是为了测量刺激之后，细胞内钙离子含量随时间变化的过程，比较不同样本之间或者不同刺激之间钙离子含量变化的差异。
具体的监测方法，请查看其它文献，此博文着重于采集钙离子流量流式数据之后，如何分析的问题。
图A：X轴为“Time”（单位为秒），Y轴为钙离子含量参数（这个例子中为Indo Ratio），图中记录了整个持续时间内所有细胞的钙离子含量。图A是在FlowJo图形窗口中选择伪色图显示的，我们只能从图中看出刺激之后，钙离子含量变化的一个大致趋势。中间断层是加药物刺激的时间。
在FlowJo的动力学平台“Kinetics”中可以进行其他的分析，比如查看median随时间变化的曲线，然后可以将不同样本之间的数据进行叠加比较。例如下面的图B和图C。
图B中，X轴为时间，Y轴为荧光强度的中位数（median）。显示的是每一个时间点的细胞荧光强度的中位数，能够反映出刺激之后，细胞内钙离子含量随时间变化的趋势，而且可以在Layout布局编辑器中将不同样本之间的趋势图叠加在一起进行比较。除了median之外，Y轴还可以选择mean、geometry mean、percentile
图C中，Y轴为“% Cells > Threshold”，显示的是：在某个时间点荧光强度大于阈值的细胞所占的百分比，比如在200秒的时候有大约90%的细胞的荧光强度在阈值之上。选择这种显示方式的时候，需要设置一个阈值（Threshold）。
二、FlowJo分析钙离子流量的步骤
演示数据：Kinetic Tutorial Data
1. 设门分析，找到目标细胞群
2. 在工作台中选中目标细胞群，到“Tools”菜单栏里选择“Kinetics”，打开动力学分析平台。
3. 打开“Options”菜单
3.1 在Statistic中选择Y轴显示的统计数据：常用的为“median”或者“% Cells > Threshold”（下拉列表中的第5个），参考原理中的有关介绍
3.2 在Smoothing选项中选择曲线光滑的方式，可以对曲线进行光滑处理
4. 如果有需要，可以创建time-slice，也就是将整个变化曲线分成多个时间段，Kinetics平台能对每个时间段的数据进行统计。
创建time-slice有三种方式，可以手动创建，也可以让软件自动创建
创建time-slice之后，Kinetics平台如下图所示，在Statistics栏里生成了各个时间段的统计数据。
5. 结果输出：
表格编辑器：进行统计数据的输出
布局编辑器：图形叠加，图形输出等
在具体的数据分析过程中，经常需要将不同样本的钙离子流量图叠加在一起，以便看出样本间的差异，比如下面的文献例子中的图。
下面的例子中，需要将M1、M2、Naive细胞的钙离子流量图叠加在仪器，步骤如下：
1) 点击
按钮，打开布局编辑器
按钮，打开布局编辑器2) 在工作台中，选中M1细胞群的“Kinetics”节点并将其拖进布局页，
3) 在工作台中，选中M2细胞群的“Kinetics”节点，将其拖到布局页中M1细胞群的图形上方，松开鼠标后二者重叠在一起
4) 同样的步骤，将工作台中Naive细胞群的“Kinetics”节点拖入布局页，得到所需要的重叠图。
如果需要更改图形的长宽比例，先选中图形，选中图形的右下角并拖动鼠标，调整图形的宽高比，如下图所示：
5) 图片保存：点击
按钮，选择文件保存的路径，并给文件命名。
按钮，选择文件保存的路径，并给文件命名。三、文献例子
下图中比较了不同样本中的钙离子流量变化情况。
文献中引用FlowJo的描述：
Intracellular calciumconcentration was determined using the FlowJo kinetic function.
图片来自于：
Julie Zikherman. 2009. PTPN22 Deficiency Cooperates with the CD45 E613R Allele toBreak Tolerance on a Non-Autoimmune Background. The Journal of Immunology
https://blog.sciencenet.cn/blog-349948-617550.html
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