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FlowJo应用常见问题及其解答
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FlowJo应用常见问题及其解答
作者：蔡何青，FlowJo 技术专员
Basic Analysis
1.散点图中怎样调整坐标轴的范围
（备注：只有FCS3.0格式的数据可以在散点图中调整坐标轴的范围。）
点击坐标轴旁边的“T”按钮，选择“Change displayed parameter range”，
在弹出的对话框中输入坐标轴范围的最小值和最大值。
2. 直方图中怎样调整Y轴的范围
在图形窗口中打开“option”选项，在“Y Axis”中选择“Auto”或者“Manual”，
Auto：自动，软件能自动调整Y轴的范围，将整个直方图显示出来
Manual：手动，需要在后面的“Max”选项中手动输入Y轴标度的最大值，然后按“回车键”确认。
比如，在此例中需要将“Max”值设为160。
备注：关于FlowJo调整坐标轴的详细内容请参考博文：FlowJo如何调整流式数据参数轴
3. 反向设门：怎样显示子细胞群在其祖先细胞群中的位置
在布局页中右键单击某个细胞群的图，在弹出的下拉菜单中选择“Show Backgating”
4. 输出图形时怎样自动对齐
在布局页中选中需要对齐的多个图形，到布局页的“排齐”菜单中选择对齐的类型，常用的有：顶端对齐(Tops)、底部对齐(Bottoms)、左对齐(Lefts)、右对齐(Rights)
5. 输出图片的格式有哪几种，哪种的分辨率最高
可输出的图形格式有6种：PNG, JPG, GIF, SVG, EMF, PDF。其中，SVG为可缩放矢量图形，EMF格式可以在microsoftoffice里面进行编辑。
在做图形输出的时候，如果是用作PPT的话，建议在FlowJo里面编辑完毕后再直接将完整的report输出到PPT，不建议在PPT里面做图形编辑。如果一定要在PPT做图形编辑的话，需将图片保存为EMF格式，这样可以在PPT2003版本里面做ungroup，进行单个编辑，不过图片插入PPT后，转变为PPT可识别的图，将会降低分辨率。
如果是用作发表文章的话，建议将图片保存为PDF格式，再在专业的图片编辑器如Photoshop或者Illustrator里面进行编辑，再输出为杂志要求的文件格式，一般为JPG,现在也有杂志倾向于接收PDF图片。
FlowJo默认的图形输出格式为PNG格式，如果需要更改，到“编辑”菜单栏里选择“偏好设置>文件格式”，在“布局编辑器”的输出格式类型中选择：
6. 是否可以调整伪色图中每个点所表示的细胞个数，即调整点的数目，使其分辨率更高
不可以调整。但是Dot Plot可以调整。(具体内容请参考博文：如何比较不同细胞数目的流式数据？)
7. 应用模板分析数据时，导入数据之后，布局编辑器里的图形批处理结果显示为“No Population”
在这个例子中，在布局页中选择“Exp1”，然后点击“Batch”按钮，重新批处理一次，便可得到结果。
8. Mean, Median, Mode, Geom.Mean的区别
Mean：平均荧光强度
Median：荧光强度的中位数
Mode：众数，是一组数据中出现次数最多的数值
Geometric mean：几何平均数，是指n个观察值连乘积的n次方根，计算公式为：
在标准的高斯分布情况下，Median=mean=mode. 通常在流式中因为总会有异常值（超高或者超低值）的存在，不是完美的高斯分布，建议使用Median，降低异常值对数据的影响。
9. 对于不同样本，目标细胞群所设的门的范围及位置不相同，是否影响可比性
不影响。同一组实验中的不同样本，目标细胞群的位置和分布范围可能会有变化，在设门的时候，需要将目标细胞群都划在门内；而在分析数据的时候，是以统计学方法分析整个细胞群的分布情况，得到百分比以及平均荧光强度等数据。因此不会影响可比性。
Compensation
1.没有补偿对照单染管（单染样本或者单染Beads）是否可以用FlowJo调补偿
不可以。不论是在仪器上调补偿，还是在软件比如FlowJo上调补偿，都必需在单染对照的基础上进行。
2. 实际实验的时候，单染管没有明显的双峰分布，应该怎么调补偿
如果没有明显的双峰分布，在设门界定阴性群和阳性群的时候：应使用区域门进行设门，阴性群和阳性群之间的距离要尽量远一些，阴性群不要包含极低值区域，阳性群不要包含极高值区域。如下图所示：
关于用FlowJo做软件补偿请参考博文：FlowJo软件荧光补偿
3. 怎样才能确定FlowJo的补偿矩阵的准确度？依据单染对照的散点图还是实验样本的？
依据单染对照进行判定。以一个两色实验为例（FL1::CD3-FITC 和 FL2::CD4-PE），在补偿之后，如果单染对照（比如FITC单染）中FITC阳性群和FITC阴性群的中位数（Median of FL2::CD4-PE）一致，说明补偿准确。
详细内容请参考博文：如何确定流式分析中荧光补偿是正确的呢？
4. 双指数转换中的3个参数分别表示什么
Width Basis：宽度基底，为负值。在图形显示效果上反映了压缩的程度。在Logicle轴中，-10表示“-101~0段”以及“0~101段”以线性形式显示，-100表示“-102~0段”以及“0~102段”以线性形式显示，如下图：左图中Width Basis为-10，右图中为-100
Extra negative decades：附加负十进位，即在坐标轴中增加的负数段的数目。“1”表示增加1个负十进位段，如下图：红色方框中的部分为在坐标轴上增加1个负十进位段
Positive decades：正十进位，表示正十进位的数目。如下图所示：
左图中Positive decades为4，表示有4个正十进位段：101~102、102~103、103~104、104~105。
右图中Positive decades为7，表示有7个正十进位段：10-2~10-1、10-1~100、100~101、101~102、102~103、103~104、104~105。
增大Positive Decades，能在二维图中以更大的空间显示低位段（0~101）的数据
Cell Cycle
1. RMS值位于哪个范围之内，周期分析结果可用
FlowJo没有给出一个确定的RMS值范围来判断周期分析结果是否可用。RMS反映的是FlowJo拟合结果和实际数据的吻合程度，吻合得越好，RMS值越小。在进行周期分析的时候，如果数据比较好，FlowJo能自动拟合得到一个好的周期拟合结果，RMS值很小。如果数据不是很理想，需要不断更改限制条件，使RMS值更小，模型拟合得更好。RMS是对同一个数据的不同拟合情况进行比较的，数值越小则拟合越好，不能用来比较不同数据间拟合的好坏。
2. CV值位于哪个范围之内，周期分析结果可用
FlowJo没有给出一个确定的CV值范围来判断周期分析结果是否可用。周期实验中CV值的大小主要是由流式仪的灵敏度及DNA染色剂的特异性决定的。
3.FlowJo拟合得到的CV值明显高于ModFit
CV为变异系数，反映的是峰的宽度。ModFit在呈现数据的时候，是将荧光强度的范围归并为256个Channel，因此在分析任何数据的时候，其坐标轴的范围均为256。FlowJo则是呈现实际的荧光强度，坐标轴的范围依据具体数据的荧光强度来确定，大于256。因此FlowJo得到的CV值高于ModFit。
下图中为同一个数据分别用ModFit和FlowJo进行分析得到的结果，左边为ModFit，右边为FlowJo。
4.FlowJo的周期模块中怎么分析凋亡
FlowJo的周期模块是专门用来分析细胞周期的，得到细胞周期各个时期的比例。分析细胞凋亡一般需要采用特定的方法，比如Annexin V-FITC/PI双标记法，用四分门设门方法来界定出凋亡细胞。
具体内容请参考博文：FlowJo分析凋亡数据
5.FlowJo的周期模块中怎么分析异倍体
FlowJo在分析细胞周期的时候，能够得到某一个细胞周期各个时期的比例。如果样本中包含有多个不同的倍体（比如同时含有二倍体以及异倍体），该样本中含有多个细胞周期，则需要借助其他的分析工具来分析。
6. “创建门”之后，各个时期的比例发生变化
创建门之前，计算细胞周期各个时期的比例是根据拟合方程计算出来的。左图为创建门之前的周期图，其中G1期与S期有相交部分，对于相交的部分，是根据方程计算出其属于G1期的可能性有多少，属于S期的可能性有多少，然后再计算出G1期细胞所占的总的比例。
创建门之后，如右图，G1期、S期、G2期之间没有相交的部分，而是硬性地设了一个门，明确规定出G1期、S期和G2期的范围。因此，创建门之后，细胞周期各个时期的百分比会发生变化。
如果周期分析的目的只是为了计算出细胞周期各个时期的比例，则不需要“创建门”。
如果周期分析之后，需要界定出G1期、S期、G2期的细胞，并对某个时期比如G1期的细胞做进一步分析，则需要“创建门”界定出各个时期的细胞。
更多关于周期分析的内容，请参考博文：FlowJo软件分析细胞周期样品
Porliferation
1 增殖分析发文章时采用哪个参数
一般采用增殖指数（Proliferation Index）和分裂指数（Division Index）
2 增殖指数和分裂指数的定义及其区别和关系
增殖指数（Proliferation Index）：分裂次数的总和除以发生过增殖的亲代细胞数目
分裂指数（Division Index）：分裂次数的总和除以增殖发生前的细胞总数
3 为什么默认的增殖峰的最大值为8
根据以往的研究结果，在CFSE法分析细胞增殖的实验中，可分辨出的最多的增殖峰的数目为8个
https://blog.sciencenet.cn/blog-349948-595644.html
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