FlowJo软件分析单标记样品

 作者：胡金涛

单标记样品在FlowJo软件数据分析中的数据显示方式是单参数直方图。单参数直方图是一维数据用的最多的图形显示形式，既可以用于定性分析，又可以用于定量分析。根据放大器类型的不同，横坐标可以是线性标度或对数标度，单位用“道数”来表示，在流式检测中的含义是代表所检测的荧光或散射光的强度。纵坐标表示的是横坐标某一特定荧光强度的细胞频数。一般为细胞的相对数，而非绝对数。

一、 FlowJo分析单标记样品的过程

1.把单标记阴性对照样品拖入FlowJo软件，双击打开原始数据。如(图一)所示：

(图一)

X轴选择FSC,Y轴选择SSC。选择上图所示的淋巴细胞群进行分析。

侧向散射SSC的含义：它对细胞膜、细胞质和核膜的折射更为敏感，其散射强度几乎与细胞内颗粒结构的质量成近似直线关系，也就是说，细胞内颗粒结构越复杂，质量越大，其SSC越大；反之则越小。

前向散射FSC的含义：该值的大小与细胞的直径近似直线关系，也就说，对于不同的细胞，细胞越大，其FSC就越大；反之则越小。

SSC/FSC图的设门原则：

（1）全血样品的二维散点图一般需要进行裂解红细胞处理，二维散点图一般包含三群细胞（淋巴细胞、单核细胞、粒细胞）。根据细胞的物理特征利用设门工具对选中细胞群进行设门。

（2）培养细胞的二维散点图比血液样品的二维散点图复杂，因为细胞要进行胰酶消化、离心洗涤。细胞状态会受到影响。这时设门是一般选择细胞状态比较的好的一群细胞进行分析。

2.在SSC/FSC图中双击淋巴细胞群，如（图二）所示：

（图二）

X轴选择FL1LOG:Control FITC,Y轴选择Histogram。使用双分门工具进行设门。（也可以使用区域门设门工具进行设门）。左边区域为阴性细胞区域，右边区域为阳性细胞区域。 相应的百分比显示在图中。

单参数直方图的设门原则

（1）单参数直方图的图形为单峰时，阴性对照设门时选择的阳性率一般在1%到2%之间。如果样品细胞的状态不好，阳性率可以适当调高。

（2）单参数直方图的图形为双峰时，阴性对照设门时选择在双峰之间设门。

3.把阴性对照样品的设置应用到样品组中。得到CD3-FITC的分析结果如（图三）所示

（图三）

左边区域为阴性细胞区域，右边区域为CD3+的区域。 CD3+的百分比为82.3%。其含义为在淋巴细胞中T细胞的比例为82.3%。

二、 单标记样品结果的分析技巧

1．先看横纵坐标，了解检测的目的，一般纵坐标代表细胞数。

2．看图形分布，直方图的峰形越往右移，代表其荧光强度越强。

3．阳性的确定是根据阴性对照细胞的基础荧光域值设定的，峰形右移，荧光信号大于基础荧光域值，表示阳性。

4．数据表示时，检测的目的物一般用各Marker区内的细胞所占百分比或者用荧光强度来表示。

三、 单标记样品的结果输出

直方图的输出根据最终的需求可以有多种输出方式

1.在双参数图上点击鼠标右键选择复制图片，可以把图片粘贴到WORD或PPT中。

2.在图形分析窗口工具栏中选择“文件”并单击，选择下拉菜单中的“另存为”，选择保存位置、重新命名文件名以及文件保存的文件类型（SVG、PNG、EMF、JPG）。

3.在FlowJo软件界面中单击打开布局编辑器，在工作台的样品空间把分析样品的结点逐个拖入布局编辑器中，在布局编辑器中可以改变图形的大小和位置。

4.在布局编辑器中可以进行图片的叠加，操作步骤非常的简单，先把阴性对照样品拖入布局编辑器中，然后把要进行图片叠加的样品拖到阴性对照图片的上面软件就可以自动进行叠加。叠加后如（图四）所示。

（图四）

 

转载本文请联系原作者获取授权，同时请注明本文来自张千君科学网博客。
链接地址：https://blog.sciencenet.cn/blog-349948-573709.html

上一篇：FlowJo如何调整流式数据参数轴
下一篇：常用流式仪荧光素的通道使用情况