博文
FlowJo分析凋亡数据
|||
FlowJo分析凋亡数据
作者：胡金涛
一、细胞凋亡的机制及染色原理
细胞凋亡又称细胞程序性死亡，有别于细胞坏死。细胞凋亡是指在一定的生理病理情况下机体为维护内环境的稳定，通过基因调控，在一系列酶的参与下，使生物体内一些无用的，老化的细胞高度有序的，自动死亡的过程。Annexin V-FITC/PI双标记法来检测细胞的凋亡是实验室通常采用的一种方法。
Annexin V-FITC/PI双标法染色的原理：磷脂酰丝氨酸（PS）能与连接素V（Annexin V-FITC）发生特异性结合。正常的活细胞带负电磷脂酰丝氨酸（PS）位于细胞膜的内侧。细胞凋亡发生时，由于细胞膜磷脂对称性的改变而使PS外翻暴露于细胞膜外。PI为核酸荧光染料，不能穿透正常细胞的细胞膜，只能进入细胞膜损坏的细胞。凋亡细胞因为PS外翻从而可以和Annexin结合，但是保持了细胞膜的完整性，不能与PI结合。当细胞凋亡晚期或发生继发性坏死时，细胞膜破坏，可以同时被Annexin V-FITC/PI着色。 所以如果是Annexin单阳性的细胞的话，就是凋亡早期细胞，如果Annexin, PI 双阳性的话，即是坏死细胞，从而使用流式细胞分析的方法区分凋亡细胞和坏死细胞。
二、FlowJo分析凋亡数据的过程
1. 把凋亡样品拖入FlowJo软件，双击打开原始数据。如(图一)所示：
X轴选择FSC-A,Y轴选择SSC-A。分析凋亡的细胞选择上图所示的细胞群体进行分析。细胞碎片不予分析。
1. 在SSC/FSC图中双击分析的细胞群体，如（图二）所示：
X轴选择FITC,用来表示AnnexinV-FITC。Y轴选择PE-Texas,用来表示PI。用四分门设门工具 界定活细胞和凋亡细胞。
三、凋亡数据结果分析
1. 用四分门设门的原则：四分门设门要根据阴性对照界定阴性置信区。根据细胞分群的趋势，四分门的界定线可设在阴性、阳性细胞的分群处，因为正常培养的细胞也会发生自然的凋亡，允许阴性对照非特异荧光信号（假阳性）一般小于1%-3%。
2. 图二中各个区域的含义：
Q1：（AnnexinV-FITC）-/PI+，此区域的细胞为坏死细胞。也可能有少数的晚期凋亡细胞在其中，甚至机械损伤的细胞也包含其中。
Q2: （AnnexinV+FITC）-/PI+，此区域的细胞为晚期凋亡细胞。
Q3：（AnnexinV-FITC）+/PI-，此区域的细胞为早期凋亡细胞。
Q4：（AnnexinV-FITC）-/PI-，此区域的细胞为活细胞。
通常统计细胞凋亡率时采用Q3+Q2。
四、凋亡数据结果输出
凋亡结果的输出根据最终的需求可以有多种输出方式
1. 在双参数图上点击鼠标右键选择复制图片，可以把图片粘贴到WORD或PPT中。
2. 在图形分析窗口工具栏中选择“文件”并单击，选择下拉菜单中的“另存为”，选择保存位置、重新命名文件名以及文件保存的文件类型（SVG、PNG、EMF、JPG）。
3. 把上述样品的分析应用到组中，在Flow Jo软件界面中单击打开布局编辑器，在工作台的样品空间把“分析的细胞群体结点”拖入布局编辑器中，在布局编辑器右上角点击Batch（批处理的按钮）将所有样本的分析进行批处理的输出。
4. 选中图片，点击右键，选择图片的属性。在图片定义窗口中，可以改变图形的类型，对图片的输出进行重新定义。如（图三）所示
（图三）
https://blog.sciencenet.cn/blog-349948-543175.html
上一篇：如何比较不同细胞数目的流式数据？
下一篇：Flow Jo软件分析细胞周期样品
