虾青素是一种具有极强抗氧化能力的酮类胡萝卜素，广泛应用于食品、医药、化妆品等行业。目前，商业虾青素大部分通过化学方法合成以及藻类天然产物提取获得，但普遍存在稳定性差以及成本昂贵等问题。酿酒酵母作为公认的食品级安全微生物，用来合成虾青素是一种很有前景的替代方法。

从生物合成途径上看虾青素是类胡萝卜素合成代谢通路的终端产物，需要将β-胡萝卜素通过β-胡萝卜素酮化酶（crtW）和羟化酶（crtZ）这两步催化最后转化为虾青素。然而在酵母中构建外源代谢途径时催化模块之间的不适配会积累大量中间产物，从而导致虾青素产量较低。为解决这一问题，天津大学元英进院士团队开发了关键酶融合协同定向进化的方法显著降低了中间产物的积累，提高了虾青素产量。该研究工作以“Directed evolution of the fusion enzyme for improving astaxanthin biosynthesis in Saccharomyces cerevisiae”为题发表于Synthetic and Systems Biotechnology。天津大学化工学院硕士研究生丁泳文为文章第一作者，贾斌副教授为文章通讯作者。

图1. 通过蛋白融合和定向进化以提高虾青素含量

图2. 构建融合蛋白

在这项研究中，研究者们设计了crtZ和crtW的融合策略，减少了虾青素生物合成过程中中间产物的积累，进一步对融合酶进行定向进化提高了催化活性。同时结合AlphaFold2工具对突变融合蛋白的结构进行了分析，分析了这些突变对蛋白结构以及功能的影响。

首先该研究通过改变蛋白顺序以及连接肽长度构建了六种不同的融合蛋白，将构建好的融合蛋白表达盒整合到产β-胡萝卜素的酿酒酵母基因组后进行发酵培养，并测定最终产物含量。结果显示，与对照菌株相比，融合蛋白使得中间产物玉米黄质和角黄素的产量分别降低了14倍和7倍，并提高了产物中虾青素的含量。

图3. 融合蛋白的定向进化

为了进一步提升虾青素的产量，研究人员通过对融合酶进行定向进化来提高虾青素的转化率。通过易错PCR对融合酶进行随机诱变，将突变库转化到产β-胡萝卜素的酿酒酵母中，从中筛选出颜色变深的菌株进行发酵培养和产物测定。最终结果表明，融合蛋白的定向进化成功地提高了酿酒酵母中虾青素的产量，通过对优势突变的组合最终使虾青素的产量提高了3.8倍。研究人员结合AlphaFold2工具对融合蛋白及其优势突变体的结构进行了分析，讨论了优势突变对蛋白结构以及蛋白与底物分子之间结合能力的影响。

图4. 蛋白结构分析：A.蛋白表面结构 B.分子对接模型

该研究开发了关键酶融合协同定向进化的方法极大的降低了中间产物的积累，解决了目前微生物生产虾青素过程中中间副产物含量高的问题，提升了虾青素的产量。为解决虾青素微生物生产过程中遇到的瓶颈提供十分有益的参考。