近年来，无细胞体系正从早期的基础研究工具转变为有前景的生物合成平台。与体内合成相比，无细胞体系具有反应条件易控、便于优化、产量高、无代谢负担及细胞毒性等优势，受到科研人员越来越多的关注。特别是，近期研究人员已利用无细胞体系成功构建了多种体外代谢途径，用于生物合成不同类型的高价值化合物/天然产物（详见李健课题组最新综述：Current Opinion in Microbiology, 2022, 67, 102142）。上海科技大学李健课题组致力于无细胞合成生物学等研究，主要方向之一是无细胞生物合成高价值的复杂天然产物。该课题组前期利用无细胞体系实现了多种天然产物的生物合成，如非核糖体多肽类抗生素缬氨霉素的体外从头合成（Metabolic Engineering, 2020, 60, 37-44）以及茶叶中具有重要生理活性和保健功能的茶氨酸（ACS Synthetic Biology, 2021, 10, 620-631）。

自然界中，L-4-nitro-Trp的生物合成途径包含两步酶催化过程，首先由一氧化氮合酶（NO synthase, TxtD）催化底物精氨酸产生NO，做为硝基供体；然后，细胞色素P450酶（TxtE）以NO和O2为底物催化色氨酸进行硝基化，产生L-4-nitro-Trp（图1）。目前，利用异源宿主细胞（如E. coli）进行体内共表达TxtD和TxtE合成L-4-nitro-Trp尚未实现，主要原因之一就是TxtD在体内难以可溶表达。另外，前期研究也表明，即使在天然宿主内过表达TxtD，也会因NO的过度积累而导致细胞毒性。针对上述问题，无细胞体系是一种潜在的解决策略。该团队前期研究表明，无细胞蛋白合成（CFPS）体系对体内难溶蛋白的表达具有显著优势，可极大的提高蛋白可溶性（Biotechnology and Bioengineering, 2020, 117, 4001-4008）；另外，无细胞体系中NO的大量积累也不会造成细胞毒性问题。

基于此，作者首先对不同的CFPS体系进行了比较和筛选，结果表明，基于E. coli制备的CFPS体系可成功表达出可溶性的TxtD和TxtE蛋白，此外通过向CFPS体系中额外添加蛋白分子伴侣能进一步提升两者的可溶性。在两个酶可溶表达的基础上，无细胞反应体系中也成功检测到了目标产物L-4-nitro-Trp。随后，利用无细胞体系开放、灵活的特点，作者对无细胞反应模式、蛋白表达时间、酶催化辅因子及反应底物等进行了全面的优化以提高产物的产量。最终，优化后的体系可合成约360 μM的产物L-4-nitro-Trp，是起始产量的10倍以上（图2）。

该研究证明以下优势，首先CFPS体系不仅可以表达一氧化氮合酶（TxtD），而且能显著促进其可溶性，实现体外催化活性；更为有意义的是，这是首次利用CFPS体系表达一氧化氮合酶这类天然产物合成途径中的特殊酶类，一方面是对CFPS表达蛋白种类的有益补充，另一方面也为无细胞体系表达天然产物合成基因簇中的其他特殊酶类提供了参考。其次，反应体系中没有活细胞参与，无需考虑NO的细胞毒性问题，这也为无细胞体系合成其他细胞毒性化合物/中间体等提供了范例。再次，无细胞体系的开放性有利于整个合成途径中关键参数/因子的快速优化，实现高效的体外生物合成。最后，研究人员指出随着无细胞生物技术的快速发展，无细胞体系将为天然产物研究提供新的思路与契机，在构建高效、高产的天然产物体外生物合成平台等方面具有广阔的应用前景。