代谢学人

Nature：WARNING！衰老给线粒体捅了大窟窿！

撰文 | 郑宇含 张婷 仲银召 张彦康 李雨

编辑 | 孟美瑶

校对 | 张彦康

  背景介绍 

细胞衰老是一种特殊的细胞生理状态，可由不同的细胞应激引发，如DNA损伤、氧化应激等。这些处于衰老状态的细胞表现为细胞周期停滞，其没有进入凋亡的主动死亡程序中，但会分泌多种因子，包括促炎细胞因子、趋化因子等，统称为衰老相关分泌表型（SASP）。SASP可通过旁分泌形式发挥作用，影响周围细胞的衰老，进而诱导衰老相关的组织功能障碍。而靶向清除衰老细胞被证明是治疗衰老相关疾病的有效方式。

线粒体功能障碍是细胞衰老的一个标志。在关于衰老细胞的研究中，研究人员发现线粒体功能障碍与衰老细胞释放SASP相关因子密切相关。并且研究人员早期的研究结果表明，清除衰老细胞中的线粒体，可抑制SASP，这提示线粒体可能是抗衰老治疗中的潜在靶点。

同时，线粒体在细胞凋亡中也发挥着关键的作用。当细胞接收到凋亡刺激后，激活BAX和BAK活化，并在线粒体外膜寡聚化，导致线粒体外膜通透化（MOMP），使线粒体内容物释放到细胞质中，引起细胞死亡。值得注意的是，目前研究发现在亚致死性应激条件下，细胞中只有一小部分线粒体发生MOMP，且不会诱导细胞死亡，这种现象被称为少数MOMP（miMOMP）（小编注：在先前的认知里，细胞中所有的线粒体外膜透化是同步发生的：要么所有线粒体全部发生外膜透化，然后细胞凋亡；要么都不发生外膜透化，细胞正常存活，没有中间状态。而Tait等通过新型成像系统对准低剂量细胞凋亡剂处理的细胞时意外发现，标志着细胞要快速死亡的“线粒体外膜透化”（MOMP）以极低的水平发生了（将其命名为少数MOMP），但没有导致细胞死亡。然而少数MOMP会导致DNA损伤，促进基因组不稳定、细胞转化和肿瘤发生）。然而，在衰老细胞中是否会发生miMOMP，还不清楚。

在本篇文章中，研究人员发现衰老细胞中通常会发生miMOMP，促使mtDNA释放到细胞质中，激活cGAS-STING通路，从而促进SASP。而体内抑制miMOMP可降低炎症因子水平，改善衰老小鼠代谢稳态。总之，这一研究表明靶向抑制miMOMP介导的炎症反应可能是治疗衰老的一种潜在方式。

敲黑板啦！

1.衰老细胞会发生miMOMP，通过BAX和BAK通道促进mtDNA向胞质释放

2.胞质mtDNA激活cGAS-STING途径促进SASP

3.线粒体动力学介导miMOMP的发生

4.药物抑制MOMP可改善衰老小鼠机体健康

研究结果

1.细胞衰老伴随着miMOMP

为了探究miMOMP与细胞衰老的关系，研究人员用3D-SIM显微镜（三维结构光照明显微镜）分析了增殖和衰老的人成纤维细胞中线粒体外膜蛋白TOM20与细胞色素c（Cyt c）的共定位水平，结果发现在增殖细胞中，Cyt c与TOM20共定位；而在衰老细胞中，线粒体外周的部分碎片（从线粒体网络中分离出来，呈球状结构）表现出TOM20阳性、Cyt c阴性特征（图1a）。Pearson相关系数分析显示，在辐射诱导的衰老细胞（Sen IR）和复制性衰老细胞中，Cyt c和TOM20的共定位减少（图1b）。此外，研究人员发现衰老细胞的细胞质中Cyt c水平（小编注：细胞色素分布在真核细胞（动物、植物、酵母、脉孢菌）的线粒体膜上，除Cyt c外其他都是紧密结合在线粒体内膜上，Cyt c因呈现水溶性，故与线粒体内膜结合不紧密。在增殖细胞中，Cyt c与TOM20共定位，表明Cytc是结合在线粒体膜上的；而在衰老细胞中，线粒体碎片是Cytc阴性的，表明Cytc并未结合到线粒体膜上，在衰老细胞中MOMP后，Cytc会被释放到细胞质中，故而细胞质中的Cytc增加）和caspase-3活性显著增加（图1c-e）。接下来，为了探究miMOMP是否伴随着BAX寡聚化（表征BAX激活），研究人员通过尺寸排阻色谱法分析发现，衰老细胞中BAX形成寡聚体，而增殖细胞中未观察到BAX寡聚化（图1f）。随后，研究人员使用BAX6A7抗体检测BAX的活化水平，发现衰老细胞中从线粒体网络中分离出的碎片中BAX活性增加（图1g）。此外，在2种人成纤维细胞（MRC5和IMR90）中，辐射诱导衰老（Sen IR）和ER-RAS-原癌基因诱导衰老（OIS）均显著上调了BAX活性（图1h-i）。总之，这些结果表明，在衰老过程中细胞线粒体会发生miMOMP。

 图1.miMOMP是细胞衰老的一个特征

2.衰老过程中细胞质mtDNA增加

据报道，在细胞凋亡过程中，MOMP会导致mtDNA释放到细胞质中，引起炎症反应，而活化的caspase可抑制这一炎症反应（小编注：MOMP致使mtDNA释放到细胞质中后会激活cGAS-STING信号通路，而凋亡致使的Caspase激活通常抑制mtDNA诱导的cGAS/STING信号，不会引起免疫响应（免疫沉默））。于是，研究人员假设在衰老细胞中miMOMP可能促使mtDNA释放到细胞质中。靶向TOM20和DNA的免疫荧光染色结果显示，与增殖成纤维细胞相比，衰老成纤维细胞的细胞质DNA水平明显升高，并且这一现象与成纤维细胞的类型以及诱导衰老的刺激方式无关（图2a-b）。同样的，在透射电镜下也观察到衰老细胞的细胞质中免疫胶体金标记的DNA水平升高（图2c）。接下来，为了明确细胞质中的DNA是否来自于线粒体，研究人员通过qPCR检测了D-loop（mtDNA标志物）的表达水平，发现在Sen IR，OIS和复制性衰老细胞的细胞质中D-loop水平显著上调（图2d）。此外，研究人员发现衰老细胞的细胞质中大多数的DNA与线粒体转录因子A（TFAM，mtDNA结合蛋白之一）共定位（图2e-f）。同时，研究人员提取增殖和衰老细胞的细胞质，WB实验结果显示与增殖细胞相比，衰老细胞的细胞质中TFAM蛋白水平显著升高（图2g），这进一步证明细胞质DNA来源于线粒体。总之，这些结果表明，衰老细胞的细胞质中存在与TFAM相结合的mtDNA。

图2.衰老细胞的胞质mtDNA水平升高

3.miMOMP介导SASP

接下来，研究人员想要探究miMOMP是否可以促使细胞衰老以及SASP。研究人员用低浓度的miMOMP诱导剂ABT-737（一种抑制抗凋亡BCL-2蛋白的BH3模拟化合物）处理增殖人成纤维细胞，低浓度的miMOMP诱导剂可激活caspase，但不会诱导细胞死亡（小编注：因为凋亡程序启动的并不彻底。作者在先前的研究中就表明，miMOMP的发生，会导致DNA损伤，进而促进基因组不稳定、细胞转化和肿瘤发生。简单来说，如果凋亡程序启动的比较彻底，那细胞就悄无声息地死亡；如果凋亡程序启动的不彻底，那细胞就会走向癌变）（附图1a-b）。结果显示，ABT-737长期处理可导致MRC5和IMR90细胞中IL-6和IL-8的分泌水平显著增加，且IL-6、CXCL8、IL1A、IL1B、IFNA和IFNB的基因表达水平显著上调（附图1c-g）。值得注意的是，ABT-737长期处理不会影响细胞分裂水平，但显著促进了细胞中衰老相关标记物γH2A.X和SA-β-Gal的水平（附图1h-j），这一结果与先前研究结果一致，即BH3模拟物可通过诱导DNA损伤来促使细胞衰老。此外，研究人员发现ABT-737处理导致细胞质中mtDNA水平显著升高（附图1k），这也与先前研究结果一致，即MOMP促使mtDNA释放到细胞质中。

据报道，mtDNA可通过BAX和BAK孔道释放（小编注：在细胞凋亡过程中，BAX与 BAK 寡聚化，在线粒体外膜中形成极大的大孔，从而介导 mtDNA 的释放 ；此外，受氧化应激的线粒体通过线粒体外膜中的 VDAC 寡聚体形成的孔可释放短 mtDNA 片段；也有研究表明，位于线粒体内膜的线粒体通透性转换孔MPTP可能参与 mtDNA 的释放）。由于观察到衰老细胞中BAX活性升高，因此研究人员想要探究BAX和BAK能否促进衰老细胞中mtDNA释放到细胞质中。首先，当以α-tubulin蛋白水平进行归一化时，衰老细胞中BAK（而非BAX）蛋白水平显著增加，而以线粒体蛋白VDAC归一化时，BAK水平无明显变化，这表明衰老细胞中BAK蛋白水平的升高可能是由于线粒体含量增加（补充图2）。接下来，研究人员用CRISPR-Cas9技术构建了同时缺失BAX和BAK的人成纤维细胞（图3a），发现BAX和BAK缺失显著抑制了衰老细胞中mtDNA向胞质释放（图3b）。为了进一步探究BAX和BAK是否影响SASP，研究人员对WT细胞和BAX/BAK双敲除细胞进行RNA-seq分析，以及对WT细胞上清和BAX/BAK双敲除细胞上清进行细胞因子阵列分析，发现BAX和BAK缺失抑制了SASP相关基因的表达，并降低了促炎细胞因子水平（图3c-d；附图2a-f）。接下来，研究人员探究了BAX和BAK缺失是否影响衰老相关细胞周期。结果发现BAX和BAK缺失并不影响细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子p21和p16的基因和蛋白水平，也不影响SA-β-Gal活性、γH2A.X水平以及Lamin B1和HMGB1蛋白水平（图3e-j, m），此外，BAX和BAK缺失也不影响Ki-67蛋白水平以及其他增殖相关基因表达（图3k-l, m）。总之，这些结果表明，miMOMP通过BAX和BAK促进mtDNA释放到胞质中调控SASP，但不影响衰老相关细胞周期变化。

有研究表明，线粒体膜通透性转换孔（MPTP）参与了mtDNA的释放。为了探究MPTP是否参与了衰老细胞中mtDNA向胞质的释放，研究人员用环孢素A（可通过与线粒体亲环素D结合抑制MPTP）处理衰老细胞，并检测胞质mtDNA水平和SASP水平，结果显示环孢素A处理并不影响胞质mtDNA含量和SASP水平（附图2g-h），表明衰老细胞中mtDNA向胞质释放过程与线粒体MPTP无关。

目前结果提示，BAX和BAK除了促进mtDNA向胞质释放外，还可能通过其他途径促进SASP。有研究表明，衰老细胞中功能失调的线粒体可引起胞质染色质片段（CCFs）含量升高（小编注：在衰老背景下，染色质从细胞核“漏出”，这被细胞视为“危险信号”，该错位染色质片段及其应答最终会导致炎症）和SASP。然而，研究人员发现BAX和BAK缺失并不影响衰老细胞中线粒体呼吸、活性氧水平或CCF含量（附图2i-k）。此外，BAX和BAK缺失也不影响衰老细胞中OXPHOS相关基因表达（附图2l）。随后，研究人员探究了BAX和BAK缺失是否会影响化疗诱导的衰老细胞中SASP。研究人员利用化疗药物阿霉素（doxorubicin）和依托泊苷（etoposide）诱导衰老的人成纤维细胞，发现BAX和BAK缺失显著抑制了SASP，但不影响衰老细胞p21和p16的表达（附图3a-l）。

有研究表明，在细胞凋亡过程中，caspase的激活可抑制mtDNA诱导的炎症反应。因此，研究人员推测BAX和BAK可能通过调控caspase活性来影响SASP。由于线粒体依赖性caspase的激活需要APAF1的参与，研究人员用CRISPR-Cas9技术敲除了人成纤维细胞中的APAF1（附图4a-b），发现APAF1缺失不影响细胞的分裂水平（附图4c）。辐照诱导WT细胞和APAF1缺失细胞衰老后，结果显示APAF1缺失也不影响细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子（p16、p15和p21）、Ki-67蛋白水平和SASP相关基因表达水平（附图4d-k）。总之，这些结果表明，衰老细胞中caspase活性并不影响SASP。

附图1.ABT-737诱导衰老细胞miMOMP并促进SASP

补充图2.增殖和衰老MRC5成纤维细胞中BAX和BAK蛋白水平

图3.BAX和BAK介导衰老细胞mtDNA向胞质释放并引起SASP

附图2. MPTP不参与BAX和BAK诱导SASP的过程

附图3.BAX和BAK双缺失抑制衰老细胞SASP

附图4.caspase激活不影响衰老细胞SASP

4.BAX和BAK在体内促进SASP

为了探究体内BAX和BAK在衰老中的作用，研究人员利用Bax^fl/flBak^-/-小鼠，并通过尾静脉注射AAV-TBG-Cre病毒（肝脏组织特异型启动子）来清除Bax^fl/flBak^-/-小鼠肝脏中BAX，随后将小鼠暴露于4 Gy的电离辐射（IR）中，先前研究已证明4Gy IR可诱导小鼠衰老和肝脏SASP（图4a），结果发现在IR处理6天后，Bax^fl/flBak^-/-小鼠肝脏中促炎细胞因子相关基因表达显著上调以及肝脏中γH2A.X水平，但不影响肝脏caspase-3水平；而BAX和BAK双敲除显著抑制了促炎细胞因子相关基因表达，但不影响肝脏γH2A.X水平和caspase-3水平，表明4Gy IR可诱导小鼠肝脏衰老而非凋亡（图4b，补充图3a-c）。接下来，为了进一步验证体内BAX和BAK调控SASP这一假设，研究人员对20月龄Bax^fl/flBak^-/-小鼠尾静脉注射AAV9-CAG-eGFP或AAV9-CAG-iCre/eGFP病毒（广谱型启动子）以敲除BAX（图4c-d），与体外细胞模型结果一致，BAX和BAK双敲除显著抑制了小鼠肝脏促炎细胞因子相关基因表达，且肝脏中CD68⁺免疫细胞以及CD45⁺CD68⁺免疫细胞数量显著下降，但不影响p16和p21基因表达，表明BAX和BAK可调控衰老小鼠肝脏SASP，但不影响衰老相关细胞细胞周期变化（图4e-h）。值得注意的是，衰老小鼠肝脏中BAX mRNA水平与促炎细胞因子相关基因表达呈正相关（图4i）。此外，研究人员还发现BAX和BAK双敲除还可抑制衰老小鼠骨骼中促炎细胞因子相关基因表达，且在衰老小鼠骨骼中BAX表达水平也与促炎因子相关基因表达呈正相关（补充图3d-f）。总之，这些结果表明，BAX和BAK在衰老小鼠和衰老细胞模型中都可促进SASP。

图4.BAX和BAK双敲除可抑制衰老小鼠肝脏SASP

补充图3. BAX和BAK双敲除衰老小鼠肝脏和骨骼SASP表型

5.mtDNA通过cGAS-STING介导SASP

有研究表明，在细胞凋亡或其他应激条件下，胞质mtDNA可激活cGAS-STING信号通路，且cGAS-STING信号可调控SASP。然而mtDNA向胞质释放、cGAS-STING信号和SASP之间的联系还不清楚。为了探究这一问题，研究人员构建了无线粒体的细胞模型（小编注：根据研究需要，研究人员早已构建了一种特殊的细胞模型,即无线粒体DNA(mtDNA-less)细胞模型或称为RHO0细胞。RHO0细胞是指一类线粒体内DNA缺失,无线粒体功能,依靠糖酵解存活的细胞系），即在人成纤维细胞中稳转YFP-Parkin，并在X射线下照射以诱导细胞衰老，随后用线粒体解偶联剂CCCP（小编注：CCCP 是线粒体中氧化磷酸化 (OXPHOS) 解偶联剂，本身并不会直接引起线粒体自噬。然而，CCCP 可诱导 PINK1 激活，促进 Parkin 在 Ser65 位点磷酸化，从而激活并招募Parkin，Parkin介导线粒体底物泛素化，泛素化后，包括p62在内的受体蛋白在线粒体外膜积累，导致泛素化产物通过与LC3结合被招募到自噬体中，成熟的自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体，包含的线粒体随后被降解。本文中是在成纤维细胞中稳转YFP-Parkin，从而通过CCCP诱导 PINK1 激活,进而激活Parkin来引起线粒体自噬）处理表达YFP-Parkin的衰老细胞，引起衰老细胞中的线粒体自噬从而耗尽细胞中的线粒体。然后用分离纯化的mtDNA转染无线粒体的衰老细胞，WB实验结果显示mtDNA并不影响线粒体蛋白NDUFB8和UQCRC2的水平；且胞质mtDNA水平的增加显著促进了无线粒体衰老细胞分泌促炎细胞因子如IL-6和IL-8（图5c-d）。同样的，对衰老细胞、无线粒体衰老细胞和转染mtDNA的无线粒体衰老细胞进行RNA-seq分析，结果表明，与衰老细胞相比，清除线粒体后显著抑制了SASP相关基因表达，而这些基因表达水平在转染mtDNA后显著上调（附图5a-c）。总之，这些结果表明胞质mtDNA可促进SASP。

据报道，TFAM缺失可导致mtDNA包装异常，从而促进干扰素刺激基因(ISG)的表达。因此为了探究衰老是否会促使ISG表达以及ISG表达是否依赖于mtDNA的刺激，研究人员分析了衰老细胞、无线粒体衰老细胞和转染mtDNA的无线粒体衰老细胞的RNA-seq数据，结果发现衰老细胞中ISG表达显著上调，线粒体清除后显著抑制了ISG表达，而转染mtDNA后重新促进ISG表达（图5e）。随后研究人员分析了该RNA-seq数据中更全面的NF-κB途径调控基因和ISG表达水平，同样发现衰老细胞中NF-κB途径相关基因和ISG表达上调，而清除线粒体后抑制了这些基因表达，转染mtDNA后重新上调这些基因表达水平（附图5b），表明在衰老细胞中，mtDNA可促进ISG的表达。为了进一步验证mtDNA可调控SASP，研究人员用溴化乙锭处理Rho0细胞以清除mtDNA，再通过X射线照射诱导细胞衰老，qPCR结果显示缺乏mtDNA的Rho0细胞中不表达MT-ND1和MT-ND5，表明Rho0细胞中mtDNA被成功清除（图5f），并且mtDNA缺失显著抑制了SASP的分泌，如IL-6和IL-8（图5g）。随后，研究人员在MRC5成纤维细胞中过表达一种由他莫昔芬诱导的病毒DNA酶（HSV-1 UL12.5），该酶可特异性靶向线粒体并清除mtDNA，发现他莫昔芬诱导HSV-1 UL12.5表达可显著降低衰老MRC5细胞中mtDNA水平，并抑制SASP相关基因表达（附图6a-e）。

鉴于目前结果表明衰老细胞中胞质mtDNA可促进SASP。接下来，为了探究胞质mtDNA促进SASP的机制，研究人员培养了WT和Tfam^+/-小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs），Tfam^+/- MEF富含胞质mtDNA，并培养至衰老状态，结果表明Tfam缺失可促使MEF发生复制性衰老，并提高SA-β-Gal活性和p16表达水平，同时NF-κB途径相关炎性因子相关基因IL-6和Cxcl15表达水平和Ⅰ型干扰素相关基因Ifit3、Ifi44和Stat1表达水平显著上调（补充图4a-4h）,这与最近的一项研究结果一致，该研究指出T细胞中缺乏Tfam可促进T细胞衰老以及小鼠机体炎症和衰老过程。随后，研究人员利用STING抑制剂SNO11处理WT和Tfam^+/- 衰老MEF，结果显示SNO11并不影响Tfam^+/- 衰老MEF的衰老程度，也不影响Tfam^+/- 衰老MEF中SA-β-Gal活性和p16表达水平（补充图4i-k），然而SNO11显著抑制了Tfam^+/- 衰老MEF中促炎因子相关基因表达（补充图4l-n），这与先前研究结果一致，即衰老细胞中cGAS-STING可促进SASP。

研究人员推测在衰老细胞中，mtDNA可能通过cGAS-STING途径调控SASP。结果显示，在衰老的人成纤维细胞中，GFP-cGAS融合蛋白与胞质TFAM的共定位水平显著增加（附图7a-b）。随后研究人员利用CRISPR-Cas9敲除细胞中cGAS或STING，发现cGAS或STING缺失显著降低了衰老细胞中IL-6和IL-8的分泌水平（附图7c-h）。而在WT细胞中转染mtDNA后，显著促进了衰老细胞中IL-6和IL-8的分泌（附图7i-j）。总之，这些结果表明mtDNA通过cGAS-STING调控SASP。

图5.胞质mtDNA介导衰老细胞SASP

附图5.线粒体缺失抑制衰老诱导的炎症，回补mtDNA能恢复其作用

附图6.清除mtDNA可抑制SASP

补充图4. Tfam^+/- MEF促进细胞衰老和SASP

附图7.细胞质mtDNA通过cGAS-STING介导衰老细胞SASP

6.线粒体动力学介导miMOMP

目前研究结果表明miMOMP可促进mtDNA向胞质释放，进而促进SASP,接下来研究人员探究了为什么MOMP仅发生在衰老细胞的部分线粒体。研究人员对增殖细胞和衰老细胞的线粒体靶向活化的BAX进行免疫沉淀，然后利用质谱分析鉴定miMOMP调节因子，与先前研究结果一致，研究人员可在衰老细胞中免疫沉淀出活化的BAX蛋白，而在增殖细胞中并没有获得活化的BAX蛋白，这表明miMOMP发生在衰老细胞中。质谱分析揭示了多个与BAX6A7相互作用的线粒体蛋白，这些蛋白主要富集在线粒体动力学、能量代谢、脂质稳态等途径中（补充图5）。接下来，研究人员分析了衰老细胞中的线粒体动力学，发现大多数衰老细胞中线粒体汇集成超融合网络，而游离线粒体或破碎的线粒体片段较少（补充图6a）。随后，研究人员用CellLight线粒体-RFP系统标记人成纤维细胞线粒体，发现在衰老细胞中线粒体分裂速率显著低于增殖细胞（补充图6b），这与先前研究一致。为了探究衰老细胞中少量的线粒体碎片是否发生MOMP，研究人员对增殖细胞和衰老细胞进行TOM20和Cyt c或BAX6A7免疫染色，发现在衰老细胞中，只有环状、碎片化的TOM20⁺线粒体呈Cytc阴性，而BAX6A7阳性（补充图6c-d），表明在衰老细胞中，只有碎片化的线粒体片段发生MOMP。

结合目前结果以及研究人员先前的研究表明，线粒体动力学在调节miMOMP方面具有重要作用，因此研究人员推测衰老细胞中线粒体超融合可能是抑制线粒体miMOMP以及mtDNA释放的机制。为了验证这一假设，研究人员利用shRNA敲减MRC5成纤维细胞中线粒体融合蛋白-2（MFN2）基因，并通过X射线照射诱导细胞衰老，发现敲减MFN2可显著促进增殖细胞和衰老细胞中线粒体断裂（附图8a-d），并且敲减MFN2还显著提高了衰老细胞中BAX6A7阳性线粒体数量、胞质mtDNA水平以及SASP相关基因表达如IL-6、IL-8和IL1β，但不影响p16和p21基因表达水平（附图8a-b,e-i）。为了进一步验证这一现象，研究人员利用CRISPR-Cas9技术构建了MFN2缺失的IMR90成纤维细胞，发现MFN2缺失显著促进了增殖细胞和衰老细胞中线粒体分裂（补充图7a-c），且MFN2缺失显著提高了衰老细胞中BAX6A7阳性线粒体数量、胞质mtDNA水平以及SASP相关基因表达（补充图7d-g）。随后研究人员采用另外一种方法进一步探究线粒体分裂在调控SASP中的作用，即采用CCCP（羰基氰化物间氯苯腙）处理衰老细胞以诱导线粒体分裂（小编注：CCCP可以诱导线粒体关键裂变调节因子Drp1的表达来促进线粒体分裂），发现CCCP处理显著提高了衰老细胞的胞质mtDNA水平和SASP相关基因表达（补充图8a-d）。总之，这些结果表明，线粒体动力学可通过调控衰老细胞中miMOMP进而影响SASP（补充图8e）。

补充图5.活化的BAX与线粒体动力学相关蛋白相互作用

补充图6.衰老细胞线粒体形成超融合网络，miMOMP仅发生破碎线粒体片段中

附图8.MFN2缺失加剧衰老MRC5成纤维细胞中mtDNA释放和SASP

补充图7. MFN2缺失加剧衰老IMR90成纤维细胞中mtDNA释放和SASP

补充图8. CCCP诱导线粒体断裂加剧了衰老细胞胞质mtDNA水平和SASP

7.抑制MOMP可以促进健康寿命

接下来，为了探究药理抑制MOMP是否可抑制mtDNA释放和SASP，研究人员使用了BAX小分子抑制剂BAI1处理细胞以抑制细胞中BAX活性，结果发现BH3模拟物处理显著促进了WT细胞、BAX缺失细胞和BAK缺失细胞的细胞死亡水平，BAX和BAK双缺失可抑制BH3模拟物诱导的细胞死亡水平，而BAI3处理可显著抑制BAK缺失细胞的细胞死亡水平，但不影响BAX缺失细胞的细胞死亡水平，这证明了BAI1可特异性抑制BAX活性（附图9a-b）。随后，研究人员探究了BAI1处理是否可影响细胞衰老，结果发现BAI1处理可显著抑制MRC5和IMR90衰老成纤维细胞中胞质mtDNA水平、BAX活性和SASP相关基因表达(图6a-b,附图9c-f)，且BAI1处理还可显著抑制ABT263诱导的细胞死亡水平（附图9g），表明BAI1抑制BAX活性可改善SASP。为了进一步验证这一结果，研究人员在人成纤维细胞中转染鲱鱼精巢DNA(HT-DNA)，可显著促进促炎因子相关基因表达，而BAX和BAK双缺失或BAI1抑制BAX活性并不影响HT-DNA诱导的细胞炎症水平，这进一步说明BAI1通过抑制BAX活性进而抑制SASP（附图9h-j）。最后，研究人员使用FDA批准药物eltrombopag治疗衰老成纤维细胞，该药物可通过不同于BAI1的机制直接抑制BAX，发现eltrombopag也可显著抑制衰老成纤维细胞中SASP相关基因表达（附图9k-n）。

接下来，研究人员探究了miMOMP药理抑制剂改善衰老的潜力。衰老过程中通常伴随着肌肉力量的下降，为了探究药理抑制MOMP是否可以改善衰老相关的肌肉力量下降现象，结果发现，BAI1治疗小鼠在转棒上所持续时间延长，且在爬杆上可保持更长的平衡时间，表明BAI1治疗可显著提高与衰老相关的神经肌肉协调能力（图6c-d，附图10a），此外，BAI1治疗还可增强衰老小鼠的前肢握力，显著改善了与衰老相关的肌肉力量下降现象（图6e-f）。值得注意的是，BAI1治疗还显著改善了衰老小鼠的健康寿命，但不影响寿命（附图10b）。随后研究人员对BAI1治疗小鼠的血浆进行细胞因子阵列分析，结果显示BAI1治疗小鼠血浆中SASP相关因子（如IL-1α，IL-6，MCP-1和TNF）水平具有降低的趋势，尽管没有统计学差异（附图10c）。

鉴于BAI1治疗显著改善了衰老小鼠的肌肉功能，且先前研究表明衰老细胞和SASP在衰老相关的骨质流失中发挥重要作用。接下来研究人员利用微型计算机断层扫描（μCT）分析来探究BAI1治疗对骨骼微结构的影响，结果显示BAI1治疗小鼠的脊柱和股骨的骨小梁数量增加，分离度下降以及骨体积分数升高，表明BAI1治疗可有效改善衰老小鼠脊柱和股骨的微结构（图6g-j）。随后研究人员分析了股骨的皮质骨，结果显示BAI1治疗小鼠的皮质骨厚度和极惯性矩增加，但没有统计学差异，这表明BAI1治疗可提高小鼠股骨的抗扭转能力（附图10d）。与miMOMP促进SASP的结论一致，研究人员发现BAI1治疗小鼠的股骨中SASP相关基因表达显著下调，但细胞周期相关基因（如p16、p21和p53）表达没有发生变化（图6k，附图10e）。

研究人员还发现BAI1治疗显著降低了衰老小鼠全脑中SASP相关基因的表达，如IL-6、Mmp13和Cxcl14（附图10f）。脑药代动力学分析显示，对衰老小鼠腹腔注射BAI1后，BAI1可穿过血脑屏障，在注射24小时后，脑中BAI1浓度达到近1000ng/g（补充图9）。为了阐明BAI1治疗对脑的作用，研究人员对BAI1治疗小鼠的全脑进行scRNA-seq分析，发现BAI1治疗显著降低小鼠脑中p16阳性细胞数量（图6l-m）。此外，研究人员还发现BAI1治疗显著抑制了小胶质细胞和少突胶质细胞中SenMayo基因组的表达水平（图6n）。结合miMOMP可促进SASP这一结论，可以推测BAI1治疗减少了p16阳性细胞数量，可能与SASP的抑制有关。总之这些研究表明药理抑制miMOMP可有效缓解大脑炎症和细胞衰老。

拓展阅读

SenMayo基因组

SenMayo 基因组是梅奥诊所研究人员开发的一个新的基因集，于2021年12月11日发表于BioRxiv上（并于次年发表于Nature communications），可用于识别衰老细胞并预测衰老相关的组织通路。

由于目前文献中“衰老基因集”的组成存在差异，在本研究中，研究人员试图通过全转录组途径（包括全转录组和单细胞RNA测序）识别各种年龄相关数据集中常见的调控基因。基于对大量文献的总结，研究人员定义了125个基因作为衰老基因集(SenMayo)，然后研究人员在老年人类和小鼠各种组织的公开数据集中验证了这一基因集，包括衰老细胞清除后该基因集的变化。基于scRNA-seq分析中识别衰老细胞的困难，研究人员将SenMayo应用于人类和小鼠骨髓/骨造血细胞和间充质细胞的scRNA-seq数据中，确定了这些分析中衰老细胞的身份，并表征了衰老造血细胞或间充质细胞与微环境中其他细胞的通信模式。最后，研究人员在衰老小鼠模型和衰老细胞的遗传清除实验中验证了计算机分析的关键预测。

总之，此研究提供了一个新的基因集(SenMayo)，它随着组织和物种的衰老而增加，对衰老细胞的清除有着明确反应，可以用于批量和scRNA-seq分析，以鉴定表达高水平衰老/SASP基因的细胞。该基因集在衰老细胞负荷的临床评估和抗衰老疗法的研究中也有潜在的效用。此外，SenMayo绕过了目前在单细胞水平上对衰老细胞的转录鉴定的限制，从而允许进行详细的分析(例如拟时间，细胞间信号传导)，这将有助于在未来的研究中更好地表征这些细胞。

参考文献：

1.Dominik S, et al. BioRxiv, 2021. 

2.Dominik S, et al. Nat Commun, 2022 ,13(1):4827.

附图9.BAI1治疗抑制衰老细胞miMOMP和SASP，但不影响HT-DNA诱导的炎症

图6.BAX抑制剂对衰老小鼠健康寿命的影响

附图10.BAI1治疗改善老年小鼠健康并缓解炎症，但不影响寿命

补充图9. BAI1可穿过血脑屏障

总结    

在本篇文章中，研究人员发现在细胞衰老过程中会发生miMOMP，导致mtDNA通过BAX和BAK孔道释放到细胞质中，激活cGAS-STING信号途径，促进SASP。进一步研究发现，衰老情况下细胞线粒体呈现超融合网络结构，而miMOMP仅发生在部分线粒体碎片中，这一现象可能是衰老细胞抑制miMOMP发生和mtDNA诱导炎症的一种机制，敲减MFN2或CCCP处理促进衰老细胞线粒体断裂后，加剧了胞质mtDNA水平和SASP。最后，研究人员利用BAX药理抑制剂治疗衰老小鼠，显著改善了衰老小鼠的肌肉力量，抑制大脑炎症，并延长衰老小鼠的健康寿命。总之，这一研究发现了与细胞死亡相关的MOMP也会发生在衰老细胞中，并促进SASP，这一发现表明抑制衰老细胞miMOMP可能是改善衰老相关疾病的有效治疗措施。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41586-023-06621-4

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