代谢学人

Nature ： 运动诱导Lac-Phe，让你吃得少又苗条

撰文 | 武霞 张俊 仲银召 郭明伟

编辑 | 孟美瑶

校对 | 张俊

背景介绍

运动提供了一种强大的生理机能刺激，可以唤起多个组织之间的相互作用。定期训练可以提高机体生理能力，改善肥胖及相关代谢性疾病。相比之下，缺乏运动增加了肥胖、代谢性疾病和全因死亡的风险。然而，关于体育运动对多个器官系统的益处，以及不活动导致的疾病和失调相关机制的认识还不完全。尽管大规模多组学研究已经解析了许多由运动调节的分子图谱，但这些分子变化和生理功能之间的关系尚不清楚。本文的通讯作者之一，Jonathan Z. Long，是代谢领域大牛Bruce M. Spiegelman的博后学生，其研究领域主要集中于信号分子对于代谢稳态的影响。他们前期通过血浆代谢组学分析发现了一些特定功能的调节代谢的信号分子，但是这些候选分子能在多大程度上代表最重要身体活动的“传感器”仍不清楚。

代谢组学是特定生物体中具有生物活性的小分子的总集合，这包括在初级代谢中通过代谢网络生物合成的内源性分子，来自饮食或环境暴露的分子(暴露组学)，以及来自微生物组的生物合成相关的分子。代谢组学既可以针对一组已知化合物，也可以“非靶向”，即试图检测和相对定量尽可能多的代谢物。代谢组的化学多样性，包括脂类、糖、氨基酸和无数其他分子类型，及其广泛的动态范围意味着没有一种化学测定方法可以在一个实验中充分描述所有代谢物。为此，作者采用了非靶向和靶向方法相结合的方法来绘制运动对代谢组的影响（小编注：靶向代谢组学主要是涉及已知代谢物的多重分析，包括使用标准品进行待测物质的绝对定性定量分析；同时使用同位素内标来提高检测的灵敏度和增强物质定性定量的准确性，减少假阳性的发生。其不足在于物质的覆盖率有限。而非靶向代谢组学是尽可能多的采集物质的信息，具有较为广泛的物质覆盖率。但由于缺乏标准品，可能会产生很多假阳性的信号（LC-MS平台尤为显著），缺乏对物质的绝对定性定量数据（NMR平台除外））。

目前认为，食欲控制中枢位于下丘脑，主要受胰岛分泌的胰岛素，脂肪组织产生的瘦素和胃肠道分泌的饥饿素等激素，以及甲状腺素和一些神经因子的控制。更具体地说，由位于下丘脑弓形核(ARC)的阿片-促黑素细胞皮质素原（POMC）神经元综合以上激素和神经信号作用，来调控食欲和进食量。2018年有研究发现，运动介导的体温升高可以激活ARC-POMC神经元上的辣椒素样受体抑制食欲，但相对温和的运动却并没有影响进食量。另外，今年4月Cell Metabolism上发表的文章揭示了CNOT6L去腺苷酶如何对刺激（运动和食物）做出反应，发现运动可以抑制CNOT6L的功能，进而稳定肝 Gdf15（Growth differentiation factor 15）和 Fgf21（Fibroblast growth factor 21）mRNA水平，增加相应的循环蛋白水平。GDF15的上调可以刺激后脑从而抑制食欲，而FGF21 的上调不仅可以影响外周组织（如肝脏和脂肪组织）来诱导能量和脂质的消耗，还可以作用于能量调控中枢下丘脑，进而抑制糖水偏好和酒精偏好。此外，多项研究表明运动诱导肌肉分泌的IL6可以穿过血脑屏障，作用于下丘脑PVN核团，进而降低食欲，提高机体葡萄糖敏感性。

在本文中，作者通过代谢组学检测运动后血浆代谢物变化，发现了从代谢燃料(乳酸)中产生的信号分子代谢物乳酰苯丙胺酸（Lac-Phe）。之后进一步发现Lac-Phe的合成是肌肽酶2（Carnosine dipeptidase II，CNDP2）介导的，在乳酸增多的情况下，其合成也会增加。巨噬细胞和单核细胞、免疫细胞（小编注：包括分布在不同器官中的免疫细胞，例如白细胞(心脏)、髓系细胞(脂肪)、粒细胞单核细胞祖细胞(骨髓)、嗜碱性粒细胞(骨髓)，参考图2a。文章只列出了前10%的细胞类型）、上皮细胞和其他CNDP2+细胞类型均分泌Lac-Phe，这表明除了肌肉外，还有许多其他类型的细胞可以感知并对身体活动做出反应。在饮食诱导的肥胖小鼠中，注射Lac-Phe可以减少进食而不影响运动或能量消耗。长期注射Lac-Phe可抑制肥胖和体重，并改善葡萄糖耐受。相反，在小鼠体内敲除Lac-Phe生物合成的基因可以增加运动训练后的进食和肥胖。最后，在人类和赛马中也观察到了循环Lac-Phe活性的增加。总的来说，这项研究发现了一项与身体活动相关的分子变化，可能为捕捉身体活动对人类健康的代谢益处提供新的治疗策略。

敲黑板啦！

1. 运动诱导小鼠和赛马循环Lac-Phe水平升高；

2. CNDP2酶催化乳酸生物合成Lac-Phe；

3. Lac-Phe抑制肥胖小鼠进食，并改善肥胖；

4. 敲除Cndp2基因导致运动后进食和体重的增加;

5.人运动后循环Lac-Phe增加。

研究结果

1.运动后血浆Lac-Phe水平升高

为了以全面且无偏倚的方式测量运动诱导的循环代谢物，作者对在跑步机上进行力竭运动的小鼠进行了靶向和非靶向的血浆代谢组学测定(扩展数据图1a)。靶向代谢组学分析检测到几种代谢物的增加，包括乳酸、延胡索酸和琥珀酸，这些代谢物之前被认为是由运动所调节的(图1a)。然而，通过非靶向代谢物组学分析发现，一种特殊的代谢物在运动后变化最为明显(图1a, b)。这种代谢物的质荷比(m/z)为236.0928，它的化学式与C12H14NO4-一致，但这样的分子与最初设置的靶标代谢物并不匹配。

另外，作者还对纯种马在比赛前后的血浆进行了靶向和非靶向代谢组学研究。据报道，赛马最大耗氧量(VO2)的增加幅度是哺乳动物中最高的(约增加45倍)，因此长期以来，人们一直在研究赛马出色的运动表现的原因。值得注意的是，非靶向代谢组学检测到同样m/z = 236.0928的分子，并且该代谢物在运动后变化最为显著(图1c, d)。

m/z = 236.0928代谢物的碎片显示出m/z = 88.040的子离子，与C3H6NO2 -相匹配(图1e)（小编注：子离子就是该母离子被质谱中的电子轰击出来的碎片离子）。在这些光谱的基础上，母质代谢物被初步确定为Lac-Phe，一种乳酸和苯丙氨酸的酰胺化共轭物(图1e)。此外，化学合成的Lac-Phe标准品表现出相同的碎片谱和保留时间(图1e，扩展数据图1b-d)。小鼠和赛马中循环Lac-Phe水平的绝对定量显示运动后峰值浓度约为2 μM(图1f, g)。小鼠的血浆Lac-Phe水平在跑步后立即显著升高，运动后1小时恢复到基线水平(图1h)。在小鼠多个组织中也检测到Lac-Phe，但组织Lac-Phe水平未因急性跑步而改变(扩展数据图1e)。此外，小鼠和赛马急性跑步后，二者血浆中另外几种乳酰基氨基酸显著增加，并且乳酸和疏水氨基酸的结合物（小编注：乳酸-氨基酸的合成可以降低底物乳酸的含量，进而维持内环境稳态。还说明在该状态下，催化乳酸和氨基酸反应的酶活性可能较高。另外，聚（乳酸-氨基酸）共聚物在保持聚乳酸良好生物相容性的基础上，还具有反应活性，亲水亲脂两亲性和降解速度可控性）增长倍数最为明显(扩展数据图1f, g)。因此得出结论，在两种动物运动模型中，Lac-Phe是一种运动诱导的循环代谢物。

扩展图1 小鼠和纯种赛马运动中Lac-Phe和乳酰基氨基酸动态的代谢组学特征

图1 小鼠和赛马一次跑步后，血浆中强烈诱导产生Lac-Phe

2. CNDP2酶催化乳酸生物合成Lac-Phe

目前，对Lac-Phe的功能研究仍然较少。此前已有报道称，运动可增加体内Lac-Phe水平。本文中的代谢组学数据进一步说明，这种增加在急性运动后最为显著。先前的体外研究证明了胞质酶CNDP2可以通过乳酸和苯丙氨酸的缩合反应催化Lac-Phe的合成(扩展数据图2a)，但这一生化反应的生理作用尚不清楚。从单细胞Tabula Muris数据库（小编注：该数据库基于来自小鼠整个生命周期内20个器官的529823个单细胞的RNA测序数据，使用两种方法分离出100000多种细胞类型进行功能注释：①基于荧光激活细胞分选：覆盖度高，可富集特定类型细胞，用于研究低表达基因，可变剪接和序列变异分析等；②基于3’末端的微流体液滴计数法：检测的细胞数量多，优势在于能够发现稀少的细胞和细胞状态。）中分析发现，Cndp2 mRNA在各种细胞类型中广泛表达(图2a和扩展数据图2b)，包括巨噬细胞和单核细胞，其他免疫细胞和上皮细胞。作者采用小鼠RAW264.7巨噬细胞系体外模拟Lac-Phe的产生。尽管CNDP2是一种细胞内的酶，但是几乎所有由RAW264.7细胞产生的Lac-Phe都分泌在条件培养基中(图2b)。在巨噬细胞系中采用CRISPR-Cas9技术敲除Cndp2(CNDP2-KO细胞)后，细胞外Lac-Phe水平降低了75%(图2b和扩展数据图2c)。向条件培养基中添加乳酸(25 mM)进一步使细胞外Lac-Phe水平提高85%(图2c)。在另外两个上皮细胞系(膀胱RT4细胞和肾脏TKPTS细胞;图2d-g和扩展数据图2d, e)中也观察到在相同的乳酸刺激下，CNDP2依赖性Lac-Phe生成现象。单次跑步至力竭后，多个小鼠组织中的CNDP2蛋白水平没有变化(扩展数据图2f-h)。因此，Lac-Phe是CNDP2产生的分泌代谢物，受胞外乳酸调节。在运动过程中产生的高水平的血乳酸和高水平的分泌Lac-Phe可能是驱动细胞内缩合反应的两个因素。

扩展图2 CNDP2蛋白在细胞和小鼠中的进一步表征和验证

图2  CNDP2依赖和乳酸依赖的Lac-Phe的体外产生和分泌

 CNDP2

在体内有两种肌肽酶：血清肌肽酶（Serum carnosinase，CNDP1）和组织/胞质肌肽酶（Tissue carnosinase or Cytosolic nonspecific dipeptidase，CNDP2）。CNDP1在体内特异性表达，如脑、血、肾和骨骼肌等，而CNDP2却广泛分布于人体组织中，但不分布于血清和脑脊液中。CNDP1和CNDP2分别由Cndp1和Cndp2基因编码，它们定位在人18号染色体上，位于头尾位置。

肌肽（Carnosine）是由 L-组氨酸、 β-丙氨酸合成的水溶性二肽。肌肽作为一种天然二肽，广泛分布于人体各器官,它具有多种生物活性，包括平衡生理性pH，螯合金属离子，抗氧化应激，抑制炎症因子表达等。在体内的代谢过程中，肌肽主要由肌肽合成酶合成，由肌肽酶降解（即CNDP1和CNDP2）。CNDP1的专一性较强，而CNDP2的专一性较差，除催化肌肽水解外，还可催化组-丙、甘-组、甘-亮、丙-组等二肽的水解。

CNDP2又被称为谷氨酸盐样羧肽酶(CPGL)，其亚型CPGL-B在不同组织中的表达具有选择性。在肝细胞癌中，该亚型可参与肝癌细胞的生长、克隆形成及侵袭等。而在胃癌中，CNDP2则表现出抑癌特性。在本文中，则首次发现CNDP2可催化乳酸合成Lac-Phe，从而在运动过程中发挥积极功能。

参考文献

[1] Kim JT, et al. Cell Chem Biol. 2019.

[2] Teufel M, et al. J Biol Chem. 2003.

3. Lac-Phe抑制进食和肥胖

在2型糖尿病知识门户网站(Type 2 Diabetes Knowledge Portal)中，人类CNDP2中有两个错义单核苷酸多态性与体重指数相关：rs373836366 D279N (P = 2.54 × 10-6，β = +0.4857)和rs780772968 K374T (P = 8.48 × 10-4，β = +0.7144)(扩展数据图3a, b)。在这些数据的基础上，作者假设运动诱导的Lac-Phe可能作为调节能量平衡的分子信号。接着使用代谢笼来确定急性处理Lac-Phe对饮食诱导肥胖(DIO)小鼠全身能量参数的影响(50 mg/kg），腹腔注射；扩展数据图3c)。小鼠腹腔注射Lac-Phe后，血乳酸水平没有变化(扩展数据图3d)。急性Lac-Phe治疗组小鼠在12小时内的进食量比对照组小鼠减少约50%(图3a)。值得注意的是，两组之间的动态活动没有差异(图3b)，这表明进食行为的抑制并不仅仅是因为运动减少。急性Lac-Phe治疗也没有改变耗氧量、二氧化碳生成或RER(扩展数据图3e-g)。在另一组DIO小鼠中，Lac-Phe给药并没有改变高岭土（Kaolin，小编注：其主要成分为氧化铝和二氧化硅，属于非营养物质。作者同时给与小鼠高脂饲料和高岭土饲料，当小鼠因为恶心反应而减少高脂饲料摄食时，会吃更多的高岭土饲料，进而间接反映小鼠的恶心状态。这里无论是否腹腔注射Lac-Phe，小鼠对高岭土饲料的摄入量无显著差异，说明小鼠并非因恶心而降低食欲）或水的摄入量，表明不是因为恶心导致的进食量减少(扩展数据图3h-j)。Lac-Phe也没有改变其他调节食欲的激素的循环水平，包括瘦素和饥饿素(扩展数据图3k, l)。在饲料喂养的瘦鼠中，即使腹腔注射高达三倍剂量(150 mg/kg；扩展数据图4)的Lac-Phe，也没有抑制小鼠进食。这些数据表明，Lac-Phe只特异性地抑制肥胖小鼠进食，并且不改变能量消耗，而对瘦小鼠无明显影响。

扩展图3 Lac-Phe注射对饮食诱导的肥胖小鼠影响的其他特征

扩展图4  Lac-Phe注射对瘦小鼠的代谢影响

DIO小鼠长期腹腔注射Lac-Phe (50 mg/kg/day，腹腔注射，持续10天)可导致累积进食量减少，体重下降(图3c, d)。10天后，Lac-Phe治疗的小鼠也表现出葡萄糖稳态的改善(图3e)和脂肪组织的减少(图3f, g)，其他器官重量没有发生改变(图3f)。肥胖小鼠口服给药Lac-Phe并没有抑制进食或体重(扩展数据图5)，这可能是由于进入消化系统的Lac-Phe肽键不稳定。对照组配对喂养的小鼠体重变化(图3h)与Lac-Phe治疗小鼠的体重变化相似（小编注：配对喂养提供给对照组小鼠的食物量与实验组小鼠的食物摄入量相匹配，以确定一种治疗对体重或身体组成的影响在多大程度上独立于能量摄入的变化），这证实了Lac-Phe对肥胖的影响完全是由于其对进食的作用。最后，尽管Lac-Phe显著抑制进食和降低体重，但单独的乳酸或苯丙氨酸并没有产生相应变化(图3i)，这表明完整的肽共轭对Lac-Phe能量平衡的影响是必要的。因此，得出的结论就是长期Lac-Phe治疗可抑制肥胖并改善葡萄糖耐受。

图3  Lac-Phe抑制进食和肥胖，改善葡萄糖耐受

扩展图5 口服Lac-Phe对DIO小鼠的代谢影响

为了确定Lac-Phe在运动抗肥胖中的生理性作用，作者使用Cndp2全身敲除小鼠作为Lac-Phe缺乏的遗传模型。与野生型(WT)小鼠相比，在CNDP2-KO小鼠中循环Lac-Phe分别在静息状态和单次跑步机跑步后大幅减少(图4a)。不同基因型小鼠的跑步至力竭的时间没有差异(扩展数据图6a)。此外，CNDP2-KO小鼠在静息状态下，血浆中其他乳酰氨基酸水平也降低了(扩展数据图6b-d)。相比之下，血浆肌肽（小编注：肌肽是一种含可溶性二肽，由β-丙氨酸和L-组氨酸在肌肽合成酶催化下结合而成。它作为一种内源性二肽，广泛分布于人体不同组织中。在功能上，肌肽可平衡生理性pH、整合金属离子、抗氧化应激、抑制炎症因子表达等。而肌肽的降解则依赖于肌肽酶，因此敲除肌肽酶2并不会影响血浆肌肽水平）水平没有变化(扩展数据图6e)。因此，CNDP2是一种主要负责体内基础代谢和运动诱导产生Lac-Phe的生物合成酶。

当以高脂饮食(60%的能量来自脂肪)喂养时，WT和CNDP2-KO小鼠进食量和体重没有显著差异(扩展数据图6f,g)，这表明减少基础Lac-Phe水平不足以改变能量平衡。因此，作者认为可能需要运动训练才能展现出CNDP2-KO小鼠的代谢表型。在另一组HFD喂养的WT和CNDP2-KO小鼠中，作者同时采用了一种中等强度，长期的跑步机锻炼方案，该方案在前人研究中显示出抗肥胖作用(以6米/分钟的速度开始，每5分钟速度增加2米/分钟，每天40分钟，每周5天)。两种基因型小鼠在这种长期运动方案下的跑步时间相等(WT小鼠，每天41±1.2 min；CNDP2-KO小鼠，每天41±1.7 min, P >0.05)。从第10天开始，相较于对照组，CNDP2-KO小鼠的进食量增加(图4b)。与此同时，与对照组小鼠相比，CNDP2-KO小鼠体重变化也越来越大(图4c)。在整个实验过程中，WT小鼠的体重增长被抑制了75%，而CNDP2-KO小鼠体重增长仅被抑制57% (P<0.05; 图4 d)。最后，组织解剖结果显示CNDP2-KO小鼠的脂肪组织质量增加，而瘦肉质量没有变化(图4e,f)。总之，敲除Lac-Phe的生物合成基因Cndp2会导致运动训练后能量摄入增加和体重增加，但对静息状态下小鼠无明显影响。

扩展图6  CNDP2-KO小鼠的其他特性

图4  Lac-Phe基因缺陷小鼠增加进食和肥胖

ATP转运体ABCC5已被证明可介导低亲和性Lac-Phe的细胞外流。然而，无论在静息状态下还是在单次跑步后，WT小鼠和ABCC5 KO小鼠之间的Lac-Phe水平均无显著差异(扩展数据图7)。这些数据表明，ABCC5的基因敲除不足以改变循环Lac-Phe的水平。

扩展图7  WT和ABCC5-KO小鼠静息或力竭运动后的血浆Lac-Phe水平

4、人运动后Lac-Phe水平升高

接下来，作者在两组独立的人体运动实验中测定了人Lac-Phe的水平。首先，作者重新分析了先前发表的一组非靶向血浆质谱数据，这些志愿者（第一组）接受了跑步机急性跑步训练(N = 36; 图5)。在整个数据库中，有一个尚未确定的峰值，对应代谢物的化学公式与Lac-Phe (C12H14NO4-)匹配，并且排在由运动诱导显著升高的代谢物第三位 (图5b)。串联质谱检测证实了这种先前未确定的代谢物是Lac-Phe(扩展数据图8a, b)。人体血浆Lac-Phe水平在运动后持续升高(图5c)。相比之下，乳酸水平在运动停止时达到峰值，并在1小时后迅速恢复到基线水平(图5c)，而苯丙氨酸水平始终未发生变化(扩展数据图8c)。

作者还测量了第二组志愿者的血浆Lac-Phe水平，他们每组都进行了三种不同的运动试验(N=8，耐力、短跑和抗阻运动实验;图5d)。Lac-Phe在所有三种运动模式中均表现出显著且持续的增长(图5e)。短跑运动诱导血浆Lac-Phe增加最多，阻力训练次之，最后是耐力训练。即使在运动后3小时，短跑组的血浆Lac-Phe水平仍高于基线值(图5e)。在所有三种运动模式中，运动前后的Lac-Phe和乳酸的倍数变化表现出很强的相关性(Pearson 's r = 0.82, P<0.0001; 图5f和扩展数据图8d)。这些数据表明，Lac-Phe是人体运动调节的最显著的代谢物之一。人体不同的身体活动方式会导致循环血乳酸浓度相关的Lac-Phe水平的不同定量变化。

图4 人运动后Lac-Phe持续增加

扩展图8 人类血浆Lac-Phe水平的其他特征

总结

运动可以预防肥胖、2型糖尿病和其他心脏代谢疾病，然而，介导运动代谢获益的分子与细胞机制还不清楚。本文中，研究人员发现运动可以诱导产生Lac-Phe，Lac-Phe可作为血源性信号代谢物抑制小鼠的食欲并抵抗肥胖。Lac-Phe由乳酸和苯丙氨酸结合生成，这一过程发生在CNDP2表达的细胞中，包括不同组织中的巨噬细胞、单核细胞以及其他免疫细胞与上皮细胞。在饮食诱导的肥胖小鼠中，利用药理学手段增加Lac-Phe水平可降低小鼠的摄食量，但并不影响小鼠的活动量和能量消耗。在Lac-Phe长期作用下可显著降低小鼠体重，缓解肥胖并改善糖稳态。相反，利用基因敲除手段抑制Lac-Phe生物合成过程，可增加小鼠在训练后的摄食量，加剧小鼠的肥胖。最后，研究人员在人体和赛马中也发现运动后血液中Lac-Phe活性显著升高，这表明Lac-Phe在多种物种和多种运动模式中均可作为运动的分子效应因子。总之，这些研究发现了一种保守的由运动诱导的代谢产物，它可调节机体食欲并影响整体能量平衡。

原文链接： https://www.nature.com/articles/s41586-022-04828-5