博文
代谢学人Nature：环肥燕瘦，竟起因乳腺
|
代谢学人
Nature ：环肥燕瘦，竟起因乳腺
校对 | 于剑
背景介绍
乳腺是皮肤的附属腺，发挥着分泌和储存乳汁的重要功能，其中乳腺导管主要负责输送和储存乳汁，成熟的乳腺导管由外层的肌上皮细胞和内层的管腔上皮细胞组成，它们紧密排列形成中空的管腔。在怀孕期，管腔上皮细胞增殖并分化成产奶的分泌泡，在受到激素刺激后，肌上皮细胞收缩，乳汁便通过导管被释放出来。肌上皮细胞末端被基底膜包裹，并嵌入复杂的基质中。其中，乳腺白色脂肪组织(Mammary gland white adipose tissue, mgWAT)是基质最主要成分，mgWAT由许多不同类型的细胞组成，包括脂肪细胞、前体脂肪细胞、间充质干细胞、免疫细胞、内皮细胞、交感神经纤维等，随着乳腺的发育，包括雌激素在内的卵巢激素水平升高，未发育导管的末端增殖并膨胀形成独特的多层上皮结构，称为末端芽(Terminal end buds, TEBs)，这些导管结构继续延伸、分叉和侧向分支，直到紧密嵌入到基质中，从而形成完整的树状乳腺导管。
乳腺发育过程是漫长复杂的，其受到激素、生长因子、受体酪氨酸激酶、细胞外基质分子和蛋白酶等多种因素调控。例如，在受到雌激素刺激后，脂肪细胞分泌肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor, HGF)作用于肌上皮细胞调节乳腺发育，而肌上皮细胞反过来也可以分泌双调蛋白(Amphiregulin, AREG)向基质脂肪细胞发出信号从而调节脂肪组织代谢，因此管腔上皮细胞和基质之间的代谢协同性对于乳腺发育和脂肪组织代谢具有重要作用。
拓展阅读
乳腺上皮细胞和脂肪细胞的相互调控功能
乳腺是一种具有树状导管网络的上皮器官，基质细胞和管腔细胞是乳腺上皮的两个主要细胞谱系。其中，大量的管腔细胞不断延伸分支形成上皮导管树，上皮导管树进而嵌入复杂的基质中，基质中包含大量对乳腺的正常发育和功能至关重要的组分。
在妊娠后期，母体催乳素水平升高，催乳素诱导脂肪组织表达细胞色素芳香化酶p450，p450通过芳香化作用将雄激素合成为雌激素，使其作用于乳腺脂肪组织，从而促进肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor, HGF)的分泌，促进乳腺上皮细胞的增殖和乳腺发育。此外，雌激素还能特异性刺激乳腺脂肪组织中胰岛素样生长因子(Insulin-like growth factor 1, IGF-I)的表达上调，而在其他组织中则不会发生刺激作用。除上皮细胞外，乳腺脂肪组织还分泌转化生长因子-β (Transforming growth factor beta, TGF-β)和血管内皮生长因子 (Vascular endothelial growth factor, VEGF)，前者可以潜在地影响正常的上皮生长和形态发生，而后者可以诱导乳腺内的血管生成。
不仅脂肪细胞可以调控上皮细胞，反过来上皮细胞也能促进脂肪细胞的发育。双调蛋白(Amphiregulin, AREG)作为上皮细胞中主要的分泌因子，其可以在基质靶细胞表面表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor, EGFR)介导下进入细胞，调控基质细胞如脂肪细胞发育。
参考文献：
[1]Gjorevski N., Nelson C. Nat Rev Mol Cell Biol.2011 Aug 10;12(9):581-93
然而，目前对脂肪组织产热和UCP1表达的研究主要集中于缺乏乳腺上皮细胞的雄性小鼠scWAT中，尚不清楚乳腺导管的旁分泌信号通路如何调节脂肪细胞代谢和产热程序。为了解答这一问题，美国西奈山伊坎医学院的Prashant Rajbhandari团队进行相关研究，其成果“Mammary duct luminal epithelium controls adipocyte thermogenic programme”近期发表在Nature上，该研究发现乳腺白色脂肪组织被交感神经激活后，其中的乳腺管腔上皮细胞通过分泌乳腺因子，进而抑制乳腺中的脂肪发育和产热，维持机体肥胖状态。
敲黑板啦！
1. 冷暴露会导致乳腺腔上皮细胞发生重塑，并分泌乳腺因子；
2. 冷暴露会导致乳腺导管及其与交感神经接触部位发生重塑；
3.乳腺导管上皮细胞通过阻断脂肪产热、米色化和能量利用来维持mgWAT的肥胖表型；
4.冷应激后乳腺luminal-AV细胞通过表达乳腺因子LCN2 抑制产热并维持mgWAT的肥胖。
研究结果
为了探究产热激活条件下mgWAT中的细胞异质性、组织间对话和细胞转录变化情况，研究人员分离出冷暴露(4°C)24h和室温(RT)条件下未交配雌性小鼠(10周龄)的mgWAT中SVF组分，并进行单细胞RNA测序(图1A)。测序数据集包含了12222个细胞中的42052个基因，其中每份样本约有2300-4650个细胞，每个细胞中检测到约2411个基因和7252个转录本（数据为中位数）。为了准确注释雌性小鼠mgWAT中的各种细胞类型，研究人员将测序数据集与其他8个已公开的乳腺组织单细胞数据集(包括来自布罗德研究所的脂肪SVF单细胞图谱、Tabula Muris单细胞图谱数据库、Tabula Muris Senis单细胞图谱数据库等)进行整合分析。比对内容主要包括：(1)鉴定细胞类型；(2)增加预测细胞类型可信度；(3)探索性别和年龄差异；(4)表征乳腺发育变化(图S1A)。在基于已知的细胞类型标记基因进一步亚聚类分析后，研究人员鉴定出脂肪前体细胞(Adipocyte precursor cells, APCs)、B细胞、巨噬细胞、T细胞、内皮细胞、免疫前体细胞、树突状细胞、施万细胞、肌上皮细胞和管腔激素感应细胞(Luminal-hormone sensing, luminal-HS)，管腔-分泌细胞(Luminal-alveolar, luminal-AV)，管腔激素感应分泌细胞(Luminal-hormone sensing alveolar, luminal-HS-AV)(图1B和图S1B、C)。
为了进一步探究肾上腺素能激活mgWAT后基质细胞的变化情况，研究人员使用t分布-随机邻近嵌入(t-distributed stochastic neighbor embedding, t-SNE)（小编注：t-SNE是一种降维技术，用于在二维或三维的低维空间中表示高维数据集，从而使其可视化。与其他降维算法(如PCA)相比，t-SNE创建了一个缩小的特征空间，相似的样本由附近的点建模，不相似的样本由高概率的远点建模。t-SNE主要是基于SNE可视化的改进，解决了SNE在可视化后样本分布拥挤、边界不明显的特点，是目前较好的降维可视化手段）技术对高维数据进行可视化，从而获得RT和冷暴露条件下的t-SNE图，t-SNE和点阵图揭示了冷暴露后SVF簇相对比例的总体变化情况(图1C)。冷暴露条件下管腔细胞的相对占比显著上调(RT 1: 7.2%，RT 2: 7.5%，Cold 1: 16.9%和Cold 2: 19.1%)，并且冷暴露条件下管腔细胞整体转录图谱也发生显著变化。为了对冷暴露后单个细胞的转录变化情况进行定量分析，研究人员将差异表达的基因表征为聚类类型的函数，并发现在冷暴露后luminal-HS和luminal-AV转录情况发生显著变化(图S1D)。在进一步对腔上皮细胞类型进行亚聚类分析(lumina-HS、lumina-AV和lumina-HS-AV)后，也发现RT和冷暴露处理存在显著的聚类差异(图1D、E和图S1E、F)。
冷暴露刺激后，SVF细胞群中的管腔细胞群显示了显著的细胞比例和转录差异，提示冷暴露时管腔上皮细胞可能发生重塑(图1C-E、图S1D-F)。为了确定冷暴露后管腔细胞中的差异表达因子，研究人员对RT和冷暴露处理后的管腔细胞亚类进行差异表达基因(Differentially expressed gene, DEG)分析，发现在luminal-HS细胞中WNT家族成员4(Wingless-type MMTV integration site family member 4, Wnt4)、激素肽adropin(Energy homeostasis associated gene, Enho)、富含亮氨酸的ɑ2-糖蛋白1(Leucine rich ɑ-2 glycoprotein, Lrg1)、甘油二酯酰基转移酶(Diglyceride acyltransferase, Dgat2)、结合珠蛋白(Haptoglobin, Hp)、β-防御素1(β-defensin 1, Defb1)、血管生成素样蛋白4(Angiopoietin-like 4, Angptl4)表达水平上调；在luminal-AV细胞中脂钙蛋白2(Lipocalin 2, Lcn2)、Angptl4、乳铁蛋白(Lactotransferrin, Ltf)和载脂蛋白B编辑复合物(Apolipoprotein B editing complex, Apobec3)表达水平上调，以及在luminal-HS-AV细胞中神经调节蛋白4(Neuregulin 4, NRG4)、铜蓝蛋白(Ceruloplasmin, Cp)、Angptl4表达水平上调(图1F、G、图S1G)。已有文献报道这些基因编码的分泌因子在全身和局部的脂质脂肪代谢中发挥着重要作用。研究人员将这些乳腺导管细胞分泌的细胞因子命名为“乳腺因子”(Mammokines)。t-SNE图展示了在冷暴露刺激下mgWAT、雄性小鼠scWAT SVF和成熟脂肪细胞的乳腺因子编码基因的相对表达水平。冷暴露后大多数乳腺因子基因在导管上皮细胞粘附分子(Epithelial cell adhesion molecule, Epcam，上皮细胞常见标志物)阳性细胞中部分表达(图S1H-K)。研究人员进一步通过RNAscope荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization, FISH)以EPCAM+和KRT8+(一种管腔上皮标记物)为探针确定了乳腺因子编码基因Enho、Mfge8、 Lrg1、 Lcn2、Hp、Nrg4、Wnt4乳腺导管腔细胞中高表达(图1H)。
图1.mgWAT的解构分析展示寒冷诱导乳腺导管上皮重塑
图S1.与冷刺激相关的管腔上皮细胞亚型的细胞百分比增加
当管腔上皮细胞受到冷暴露刺激后，其转录组状态可能发生改变。肾上腺素能受体β1(Beta 1 Adrenergic, Adrb1)在管腔细胞中的定位表达结果表明，冷暴露后交感神经系统(Sympathetic nerves, SNS)的激活可能直接调控这些管腔上皮细胞(图1D、图S1H)。为了确定交感神经是否能够调控管腔上皮细胞，研究人员使用了Adipoclear技术绘制乳腺组织高分辨率3D图像（小编注：Adipoclear技术是基于iDISCO技术对组织进行荧光染色和组织透明化，并结合显微镜进行3D成像)。研究人员分析了交感神经标记物酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase, TH)的三维分布、密度及其与EPCAM+乳腺导管细胞的关系。结果发现，冷暴露后乳腺导管形态产生明显的变化，主要表现为EPCAM+分支和末端导管分支增加(图2A、图S2A)，这与目前研究发现β1AR和β2AR激动剂异丙肾上腺素治疗后导管分支增加的情况一致。进一步分析表明，在mgWAT中，神经纤维、乳腺导管和分泌泡结构相互交织在一起。然而，通过光片荧光显微镜(Light Sheet Fluorescence Microscopy, LSFM)观察，研究人员发现冷暴露不会对导管体积、神经体积或导管与神经体积比值产生影响(图2B)。为了进一步研究交感神经和乳腺导管之间的相互作用，研究人员对6个RT小鼠和5个冷暴露处理的小鼠mgWAT脂肪垫的6个区域进行了共聚焦成像，结果发现冷暴露后mgWAT导管中的EPCAM染色荧光强度和EPCAM+细胞均显著增加(图2C、D)，这与scRNA-seq的结果一致。此外，研究人员还发现在冷暴露处理小鼠的mgWAT中，TH+神经纤维和EPCAM+导管之间的神经导管点（小编注：神经导管点为神经纤维与导管之间的接触部位）体积有增加的趋势(图S2E)。与对照组相比，冷暴露后mgWAT的TH强度（TH强度随着交感神经激活而增加）在神经导管点处显著增加(图2C、G)，同时EPCAM+强度在神经导管点处也显著增加(图2C、E、F)，并且ADRB1在管腔细胞中局部表达带来的影响与冷暴露相似。冷暴露24小时后，TH体积呈现增加的趋势(图S2J)，但整个脂肪垫的导管、神经体积和TH强度没有发生显著变化(图S2C-I)。综上数据显示，在冷暴露24小时后，乳腺导管及其与交感神经支配发生了实质性的重塑。
图2.SNS纤维直接支配乳腺导管上皮
图S2.SNS纤维直接支配管腔上皮细胞
为了探究冷暴露增加管腔上皮细胞群转录状态(图1)是否与乳腺导管EPCAM强度-SNS神经支配直接相关(图2)，研究人员从RT和冷暴露小鼠的mgWAT中纯化EPCAM+和EPCAM−细胞，并对EPCAM和CD49F（小编注：CD49F是一种星形胶质细胞和人骨髓来源干细胞标记物，也被称为整合素α6）进行荧光激活细胞分选(Uorescence-activated cell sorter, FACS)分析，以检测冷刺激后管腔细胞群的变化(图S2)。研究人员筛选出三种细胞类型EPCAM−/loCD49Flo(基质细胞)、EPCAM+/hiCD49Fhi(管腔细胞)和EPCAM−/loCD49Fhi(基底细胞)(图S3A)，管腔细胞仅在EPCAM+细胞中富集，并且冷暴露后细胞数量呈冷依赖性增加。此外，在EPCAM+细胞中，冷暴露后的基底细胞数量显著减少，该结果与图1C中的scRNA-seq数据一致。EPCAM抗体的非特异性相互作用可能是EPCAM+群体中仍存在少量的基质细胞的原因(图S3A)。这些数据表明，导管上皮细胞中的管腔细胞和基底细胞对冷刺激有着不同的反应(图S3A)。已知管腔上皮细胞表达Adrb1，因此研究人员使用β1AR和β2AR激动剂异丙肾上腺素来模拟冷暴露激活SNS产生的儿茶酚胺，然后检测原代EPCAM+ mgWAT中乳腺因子的表达，发现异丙肾上腺素处理后冷诱导的乳腺因子表达水平上调(图S3B)。为了确定肾上腺素能激活的管腔细胞是否参与mgWAT脂肪产热程序，研究人员通过磁性细胞分选技术(Magnetic Activated Cell Sorting, MACS)（小编注：MACS通过结合有抗体的免疫磁珠与样品细胞进行孵育，表达有相应抗原的细胞就会特异性的结合在包被有抗体的免疫磁性微粒上，当体系缓慢的经过磁场时，带有磁珠的细胞就会滞留在磁铁上，而非目的细胞由于未结合磁珠仍存在于混合细胞悬液中，从而达到分离纯化细胞的目的）去除了mgWAT SVF中的EPCAM+细胞，并将含有或不含有导管的SVF细胞分化为米色脂肪细胞(图3A)，发现与未去除EPCAM+的SVF分化的米色脂肪细胞相比，去除EPCAM+的SVF分化的米色细胞中Ucp1、Cox8b、Ppargc1a和Cidea等产热基因的表达水平上调，冷暴露则会进一步放大这种效应(图3A、图S3C)。为了进一步探究腔上皮细胞和脂肪细胞的相互调节，研究人员开发了一个体外共培养系统，该系统混合了成脂10T1/2细胞与非转化小鼠乳腺NMuMG细胞系，其中NMuMG细胞系来源于具有管腔特异性表型的“正常”乳腺上皮。与单一细胞培养相比，和细胞密度低至2.5%的NMuMG细胞共培养会导致脂肪细胞Ucp1和米色化表型显著降低(图S3D-G)，而白色脂肪细胞分化没有变化。NMuMG细胞在共培养中的比例越高，Ucp1、Cox8b和Ppargc1a等产热基因的相对表达量越低(图S3D-G)。在Transwell共培养系统中，研究人员进一步证实了管腔上皮细胞对米色分化SVF细胞、10T1-1/2和APCs脂肪细胞的干扰和抑制产热作用(图3B、图S3H-M)；利用Seahorse实验对线粒体呼吸进行分析后发现管腔上皮细胞会抑制脂肪细胞的耗氧量，这进一步证实管腔细胞能够抑制脂肪细胞产热程序(图3B、图S3J-L)。
图S3.乳腺管腔上皮细胞抑制脂肪细胞产热
为了探究导管上皮细胞在体内和体外脂肪组织产热过程中发挥的作用，研究人员构建了4个互补的导管清除模型：(1)ɑ-雌激素受体(ɑ-estrogen receptor, Esr1)KO小鼠；(2)缺失或腺导管低表达的雄性小鼠；(3)5周龄雌性小鼠的腹股沟(含有导管)或背腰(不含有导管)部分和(4)通过遗传和化学手段去除导管的小鼠，并将上述4个小鼠模型与年龄相似的雌性小鼠mgWAT进行对比。研究人员首先从雄鼠iWAT和雌鼠mgWAT中分离出SVF，用含有或不含有异丙肾上腺素培养基将SVF分化为米色脂肪细胞。结果表明，与雌鼠mgWAT的EPCAM+ SVF细胞相比，雄鼠iWAT的SVF细胞UCP1表达水平和米色化水平显著上调(图3C、图S4A)。与体外培养细胞数据一致的是，雌鼠mgWAT产热基因如Ucp1、Cox8b和Ppargc1a的表达水平在冷刺激后也显著低于雄鼠iWAT(图3D)。由于肾上腺也会分泌儿茶酚胺，因此研究人员通过手术切除雄性和雌性小鼠的肾上腺以确定SNS产生的儿茶酚胺对雄鼠iWAT和雌鼠mgWAT的脂肪组织产热的影响，结果发现与切除肾上腺的雄性小鼠相比，切除肾上腺的雌性小鼠scWAT产热基因表达水平显著降低 (图S4B)。由于mgWAT几乎占据雌性小鼠的所有皮下脂肪量（小编注：作者文中引用文章“Integrated morphodynamic signalling of the mammary gland”，该综述提出雌性小鼠的皮下脂肪主要由乳腺脂肪组成），因此研究人员推测脂肪细胞产热大幅降低可能会影响机体的能量代谢。为了验证这一想法，研究人员使用间接量热法对年龄相近的雄性和雌性小鼠进行能量消耗测量，发现雌性小鼠在寒冷暴露后的能量消耗和耗氧量均显著低于雄性小鼠(图3E、图S4C)，但雌性小鼠的呼吸交换比（RER）明显高于雄性小鼠，这表明mgWAT可能通过抑制寒冷诱导的脂质动员、脂肪氧化和产热来维持冷胁迫下的肥胖(图3E、图S4D)。基于广义线性模型(Generalized linear model, GLM)的回归分析显示，以脂肪质量作为协变量时，雌雄之间的RER存在显著的群体和交互效应（小编注：由于雌鼠平均体重与雄鼠平均体重存在差异，导致雌鼠平均脂肪质量与雄鼠平均脂肪质量存在差异，因此以脂肪质量作为协变量可能会影响对雌雄鼠RER的分析）(图S4D)，但雌雄鼠的活动量和摄食量都没有显著差异(图S4E)。此外，雄性小鼠在冷暴露期间体重和脂肪质量显著下降，而雌性小鼠在冷暴露前后没有差异(图3F、图S4F-H)。与雄性小鼠iWAT相比，冷暴露后雌鼠mgWAT中UCP1蛋白水平显著降低(图S4I、J)。接下来，研究人员比较了WT和Esr1-KO小鼠（雌性小鼠表现为乳腺导管发育不良）在冷诱导条件下产热基因表达程序之间的差异，结果发现Esr1-KO小鼠冷暴露后mgWAT的多房脂肪细胞数量明显增加，Ucp1和其他产热基因表达水平显著上调(图3G、图S5A)。在小鼠出生后五周时，乳腺导管集中在腹股沟部分并靠近淋巴结，在mgWAT的背腰椎部分则几乎无法检测到（小编注：小鼠腹股沟的第四腺体是大多数小鼠乳腺研究的首选腺体，此处乳腺脂肪组织对应iWAT），因此这种发育特征提供了解剖学上的固定点，通过解剖mgWAT可以测试导管上皮在脂肪产热过程中的作用。研究人员将5周大的雌性小鼠暴露于寒冷环境中，并解剖腹股沟和背腰椎区域测定脂肪组织转录水平，发现Epcam转录本仅存在于腹股沟区；Ucp1在腹股沟区表达增加（小编注：此处作者后文说明Ucp1的表达可能还会受脂肪组织区域影响，腹股沟区和背腰区的神经纤维密度不同，而UCP1米色脂肪细胞更集中于神经纤维密集的地方）；其他产热基因在两个区域的表达水平则没有显著差异(图3H)。先前有研究报道，5周龄小鼠腹股沟区和背腰区的白色脂肪组织存在差异，并且Ucp1的表达可能受区域影响而非管腔细胞调控。但研究人员在实验中发现，与前文中的RER数据相一致的是(图3E、图S4D、H)，腹股沟区域参与脂质动员的基因如含Patatin样磷脂酶域蛋白2( Patatin-like phospholipase domain-containing protein 2, Pnpla2)和激素敏感性脂肪酶(Lipase, Lipe)的表达也显著低于背腰区，这表明导管上皮可能抑制冷暴露引起的脂质动员。乙醇是一种相对安全的化合物，在临床上常用作消融和硬化剂，在导管内注射70%乙醇能够有效地破坏乳腺上皮而不损伤周围基质和血管系统。为了验证导管内注射技术的可行性，确保乙醇能够准确进入乳腺导管，研究人员使用伊文思蓝或GFP注射小鼠mgWAT的第四和第五乳头进行测试(图S5B、C)。然后研究人员分别给小鼠的导管内注射乙醇或PBS，结果发现与图3D、G、H的数据一致，导管内注射70%乙醇可去除导管，产热基因表达水平和UCP1蛋白水平显著上调(图3I、J、图S5E、F)。这一结果与在Krt8-DTR（Krt8启动子控制下表达白喉毒素受体(DTR)）小鼠两侧导管分别注射白喉毒素A(Diphtheria toxin A, DTA)后导管周围的UCP1表达水平上调结果相一致(图S5D)。但出乎意料的是，对照组小鼠的管腔上皮细胞中也发现了明显的UCP1染色(图5D)。研究人员还在导管内注射了0.5%胰蛋白酶（可清除前列腺导管中的管腔细胞群）进行对比。与导管中注射乙醇相比，胰蛋白酶对包括脂肪细胞在内的基质细胞造成了实质性损伤，产热基因表达水平则与注射PBS对照后的情况相似(图S5E、G)。总而言之，上述数据表明乳腺导管上皮细胞通过阻断脂肪的产热、米色化和能量利用来维持mgWAT的肥胖表型。
拓展阅读
不同类型的脂肪组织
哺乳动物中主要存在白色脂肪组织（White adipose tissue, WAT）和棕色脂肪组织（Brown adipose tissue, BAT）两种类型的脂肪组织。其中，WAT通过储存和释放脂质控制机体能量稳态以响应全身营养和代谢需求。按照分布位置不同，WAT主要分为位于皮肤下的皮下白色脂肪组织（Subcutaneous white adipose tissue, SWAT）和内脏白色脂肪组织（Visceral white adipose tissue, VWAT），VWAT主要包括网膜，肠系膜，腹膜，性腺和心外膜WAT，SWAT主要包括真皮、乳腺、骨髓WAT。VWAT和SWAT具有不同的代谢功能，但都与机体维持代谢平衡密切相关。
小鼠含有五对乳腺，根据乳腺沿线轴的前后位置依次编号为一到五。目前对乳腺的研究中大多集中于位于SWAT腹股沟的第四腺体。以淋巴结（Lymph node, LN）作为分界点将腹股沟SWAT分为腹股沟区（Inguinal, ING）和背腰区（Dorsolumbar, DL）两个区域。 研究发现ING区域UCP1表达和交感神经密度显著高于DL区，且mgWAT的乳腺导管集中在ING区的淋巴结周围，在DL区则几乎无法检测到。由于两区域微环境的差异，本文作者认为SWAT的ING区和DL区具有不同的代谢表型和交感神经密度，并以此为基准进行了区分研究。
参考文献：
[1] Zwick RK et al.Cell Metab. 2018 Jan 9;27(1):68-83.
图3.乳腺管腔上皮细胞可直接抑制脂肪细胞的产热作用
图S4.冷暴露下雌性小鼠维持肥胖
图S5.乳腺导管的破坏增强了mgWAT的功能
5、出生后早期的肥胖会上调脂肪细胞IRF7的表达水平
研究结果表明，SNS介导的乳腺管腔上皮细胞和脂肪细胞之间的相互作用可能会对脂肪细胞的产热作用造成影响。在使用肾上腺素能刺激乳腺导管细胞并进行DEG分析后，结果显示luminal-HS细胞中编码Lrg1和Enho等因子的基因上调，luminal-AV细胞中编码Lcn2的基因上调。有文献报道这些因子在脂肪代谢过程中均具有重要的调节作用。通过scRNA-seq和RNAscope FISH检测比对，研究人员确定这些因子也在乳腺EPCAM+细胞中高度富集(图1)。在冷暴露后，Enho和Lrg1在乳腺导管细胞中显示出局部区域的高表达，但即使在RT样本中也存在乳腺导管外的其他区域表达(图S6A、B)。与对照组相比，在米色分化的mgWAT SVF中添加重组Adropin或LRG1并没有改变脂肪组织产热水平(图S6C)，冷暴露后LRG1敲除(Lrg1-KO)小鼠和WT雌性小鼠的mgWAT产热基因表达水平也没有出现差异(图S6C、D)。这些数据表明，luminal-HS细胞表达的adropin和LRG1可能不直接参与脂肪产热，而是在mgWAT中发挥其他代谢作用。Lcn2在雌性性腺白色脂肪组织gWAT中显著下调，与这一现象相伴随的是女性gWAT缺乏乳腺导管且高表达Ucp1。为了进一步确定Lcn2和Ucp1的表达相关性，研究人员对来自杂交小鼠多样性组(Hybrid Mouse Diversity Panel, HMDP)（注：HMDP包括约 100 个不同遗传品系和300多只小鼠）（小编注：文中引用了16年HMDP的综述The Hybrid Mouse Diversity Panel: a resource for systems genetics analyses of metabolic and cardiovascular traits，综述中提供了HMDP数据库的使用案例和方法。部分数据已经并入Jax 物种数据库(Phenome.Jax.org)和 GeneNetwork 数据库(www.GeneNetwork.org)，这些数据库均可免费使用。此外，其他预计算数据可通过UCLA数据库(https://Systems.Genetics.ucla.edu/)获取）的小鼠白色脂肪组织数据进行了Meta分析，结果发现在雌性小鼠中Lcn2和Ucp1表达存在显著的负相关，而雄性小鼠中没有显著相关性(图S6E)。与雄鼠scWAT相比，冷暴露后雌鼠mgWAT中Epcam和Lcn2表达水平上调而UCP1表达水平下调(图3D、图S6F)，SVF scRNA数据显示女性mgWAT 中Lcn2主要定位在管腔细胞(图S6G)。LCN2蛋白几乎只在mgWAT的管腔上皮细胞中检测到，并且冷暴露和异丙肾上腺素处理会导致mgWAT导管中的LCN2蛋白和Lcn2 mRNA水平的上调(图4A、B、图S6H-J)。接下来研究人员使用单细胞调控网络分析工具(Single-cell regulatory network inference and clustering, SCENIC)确定冷暴露诱导的转录因子动态变化情况，结果显示冷诱导的转录因子活性高度活跃(图S6K)。调控因子活性表明BHLHE41(Class E basic helix-loop-helix protein 41, BHLHE41)是luminal-HS 细胞中基因的主调控因子，而E74样因子5(E74-like factor 5, ELF5)也表现出被寒冷激活的表达特性，因此可能直接参与调控Lcn2和胰岛素样生长因子结合蛋白5(Insulin Like Growth Factor Binding Protein 5, Igfbp5)等乳腺因子的表达(图S6K、L)。ELF5 是乳腺腔分泌泡发育的重要转录调控因子。作为管腔细胞中被肾上腺素能激活的主调控因子，ELF5 可以在冷应激下增强乳腺因子的表达，从而证明了乳腺因子LCN2在冷胁迫下的管腔特异性活性来源。结合图3D-F和图S4E-G数据，在冷暴露条件下与野生型对照小鼠相比，Lcn2-KO雌性小鼠的体重和scWAT重量显著下降，且scWAT重量与LCN2-KO雄性小鼠相似 (图S6M、N)。管腔上皮分泌LCN2可能是乳腺导管阻止脂肪组织过度产热并维持肥胖的潜在机制，这也解释了雄性和雌性小鼠LCN2在脂肪代谢研究中相互矛盾的结果。为了确定LCN2配体肾上腺素能可以通过时间依赖性的方式上调LCN2表达，研究人员使用基于多西环素(Dox)的四环素诱导 DTA 系统，在管腔上皮细胞特异性Krt8基因启动子的控制下，表达四环素转录因子rtTA的小鼠(Krt8-rtTA小鼠)与表达可在Dox存在下激活的tetO-DTA的小鼠杂交，使得该模型能够以时间依赖的方式去除管腔细胞。从Krt8-rtTA-DTA小鼠中分离出的乳腺导管类器官显示，在异丙肾上腺素处理后LCN2蛋白表达增加，而Dox处理后会抑制LCN2蛋白表达(图4C、图S6O-T)。为了探究LCN2在调节mgWAT产热中的生理作用，研究人员在 Lcn2-KO 小鼠的mgWAT中注射LCN2或GFP的AAV病毒（在Adipoq启动子下表达），从而特异性地在 Lcn2-KO 小鼠的白色脂肪组织中诱导外源 Lcn2 的表达，并以此模拟冷诱导和脂肪细胞特异性LCN2上调对mgWAT的影响。研究人员对注射了adipoAAV-LCN2的小鼠的mgWAT中获得的无偏大量RNA测序数据进行分析，发现LCN2表达水平并没有超过生理水平(图4D、E)。外源性表达Lcn2显著降低产热基因如Ucp1、 Cidea和Ppara表达水平，并上调了成脂基因如Lep、Mmp12、 Zfp423和Lbp的表达。Lcn2过表达也导致了醛脱氢酶1A1(Aldehyde dehydrogenase 1-A1, Aldh1a1)（该基因被认为通过下调UCP1表达水平来抑制产热）表达水平上调。研究人员通过定向qPCR对重新表达LCN2的Lcn2-KO小鼠和WT小鼠的mgWAT组织(图S7A)以及米色分化的重组LCN2的Lcn2-KO细胞进行验证(图4F)。为了确定冷暴露条件下LCN2的作用，研究人员将雄性和雌性Lcn2-KO小鼠和WT小鼠处于冷暴露环境或室温24h，发现冷暴露处理的雌性Lcn2-KO小鼠的mgWAT产热基因Ucp1表达水平上调且米色化程度增加，表明LCN2是参与调节mgWAT米色化的潜在限制因素(图S7B、C)。此外，在Lcn2-KO 小鼠导管内重新注射编码LCN2的腺病毒以恢复乳腺上皮细胞中的LCN2表达会重新增强LCN2对mgWAT的产热抑制作用(图4G、图S7d)。总之，本研究的scRNA-seq分析和mgWAT乳腺导管特异性实验数据证明，LCN2是一种在luminal-AV细胞中表达的乳腺因子，它可以在冷应激期间抑制产热并维持mgWAT的肥胖。
图4.LCN2维持mgWAT肥胖
图S6.LCN2是一种冷诱导的乳腺因子，参与阻断冷诱导的脂肪细胞UCP1表达
图S7.LCN2是一种参与阻断共定位脂肪细胞UCP1表达的乳腺因子
总结
在本研究中，研究人员发现SNS直接支配乳腺上皮EPCAM+腔细胞，腔细胞被激活后分泌LCN2等乳腺因子，LCN2抑制冷暴露下mgWAT脂肪细胞中Ucp1的表达，EPCAM+管腔上皮细胞的缺失增强了体外分化的mgWAT前脂肪细胞表达UCP1的能力，而缺失导管上皮细胞的雌性小鼠产热能力显著增强，该研究揭示了乳腺导管管腔细胞对脂肪细胞Ucp1表达和产热程序的直接抑制作用，并揭示了乳腺因子调节性别特异性局部和系统能量稳态的潜力，为探索与乳房和新陈代谢有关的疾病提供潜在治疗基础。
https://blog.sciencenet.cn/blog-3483272-1398602.html
上一篇：代谢学人Nature ：八角笼中——相分离抑制铁死亡新机制！
下一篇：代谢学人 Nature ： 运动诱导Lac-Phe，让你吃得少又苗条
