代谢学人

Nature Metabolism：氨中毒，SIRT4前来救驾

撰文 | 郭文秀 高铭远 生茂正 于剑 

编辑 | 孟美瑶

校对 | 于剑

背景介绍

目氨基酸是生物体内构成蛋白质分子的基本单位，与生物的生命活动有着密切关系。糖类是主要的能源物质，当细胞中的血糖浓度不足时，细胞可以通过分解脂肪酸和氨基酸产生能量，氨基酸首先要经过转氨反应脱去氨基，生成相应的酮酸，酮酸进入三羧酸循环或者经过脱羧、氧化、还原等各类反应被氧化为二氧化碳和水（小编注：糖尿病中由于机体出现代谢紊乱导致酮体丙酮、β羟丁酸、乙酰乙酸累积过多，会导致代谢性酸中毒即酮症酸中毒，而本文探讨的氨基酸代谢产生的酮酸如果代谢受阻会导致氨的累积增强，引发氨中毒），同时产生能量。

为了解决这些问题，复旦大学赵世民、徐薇及赵健元教授团队合作研究，其成果“Amino acids downregulate SIRT4 to detoxify ammonia through the urea cycler”近期发表在Nature metabolism上，该研究揭示了通过对氨基酸水平的调控，SIRT4能够影响OTC的CP-K修饰，从而调控OTC活性和尿素循环过程，调控氨的产生和清除，确保细胞内的氨稳态。

图S1.CP-K抗体和SIRT4敲除小鼠特征

2、氨甲酰化和SIRT4底物的鉴定

接着，研究人员使用蛋白质组学和相互作用组筛选等方法来鉴定具有CP-K修饰且受SIRT4调控的蛋白质。研究人员首先在小鼠肝原代细胞中使用抗氨基甲酰赖氨酸抗体来富集由蛋白质组生成的CP-K修饰的胰蛋白酶肽，然后用质谱鉴定CP-K肽序列及其对应的蛋白质（图S2A）。通过此方法共鉴定出142个CP-K修饰蛋白（图2A）。随后，研究人员使用异位表达的SIRT4作为位点，通过邻近蛋白标记技术(Biotin identification, BioID)鉴定出小鼠肝癌Hepa1-6细胞中135个与SIRT4相互作用的蛋白（图2A）。通过比对两种方法的结果，最终鉴定出22种蛋白质（图2A），其中大多是线粒体代谢酶，包括谷氨酸脱氢酶(Glutamic dehydrogenase, GDH)、丙酮酸脱氢酶E1α1(Pyruvate dehydrogenase E1-α, PDHA)、谷氨酸草酰乙酸转氨酶(Glutamic oxaloacetic transaminase, GOT2)和鸟氨酸氨甲酰基转移酶(Ornithine transcarbamylase, OTC)，其中GDH是SIRT4的已知的ADP核糖基化底物。

研究人员进一步发现SIRT4能够下调HEK293T细胞和Sirt4 ^{- / -}小鼠肝脏线粒体裂解物蛋白中的GDH、GOT2、PDHA的CP-K水平（图S2B-D），而SIRT3和SIRT5处理不能改变这些蛋白的CP-K水平（图S2B-D）。这些结果表明SIRT4可能调节多种线粒体代谢酶的CP-K水平进而协调线粒体代谢。

通过对野生型小鼠和Sirt4 ^{- / -}小鼠的肝脏细胞进行无偏代谢组学分析，研究人员在756种代谢物（图2B）中发现23种存在显著差异（图S3A）。代谢组学分析发现在Sirt4 ^{- / -}小鼠中，尿素循环是最主要的上调途径（图2C）。在使用LC-MS对小鼠肝脏和肾脏的代谢物进行靶向分析后，作者发现Sirt4 ^{- / -}小鼠肝脏和肾脏中尿素循环代谢物的水平均上调（小编注：天冬氨酸是尿素循环的重要原料之一）（图2D、图S3B-G）。此外，研究人员使用13C对葡萄糖进行同位素标记，然后发现碳水化合物限制后13C标记的天冬氨酸水平下调（图S3J），而未被标记的天冬氨酸水平上调（图S3K）。这一结果与葡萄糖饥饿后激活溶酶体的现象相似，即为氨基酸的分解代谢提供原料。然后研究人员发现Sirt4 ^{- / -}小鼠中13C标记的天冬氨酸水平未发生变化（图S3H、I），因此Sirt4敲除小鼠中尿素循环代谢物上调所利用的天冬氨酸不是来自于葡萄糖代谢（图2E）。已知CP通过OTC进入尿素循环，生成尿素将氨排出体外。综上这些结果与蛋白质组学结果共同表明，SIRT4可以调节OTC活性，OTC进而介导CP进入尿素循环并由此启动尿素循环。

拓展阅读

尿素循环

中枢神经系统氨是生物体代谢产生的副产物，氨的含量过高会导致生物体氨中毒，肝脏作为主要的解毒器官之一，可以利用尿素循环将氨和天冬氨酸的氮转化为尿素，随后通过尿液将尿素排出体外。尿素循环(Urea cycle)，亦称鸟氨酸循环，该循环主要发生在脊椎动物的肝脏中，小范围发生在肾脏中。生物体饮食摄入和代谢产生的NH₄⁺首先被转运到肝脏的线粒体内，在CPS-I的作用下与CO₂结合生成CP，生成的CP在OTC的作用下与鸟氨酸反应转变为瓜氨酸。在被转运出线粒体后，瓜氨酸在精氨酸代琥珀酸合成酶(Argininosuccinate synthetase, ASS)催化下与天冬氨酸反应生成精氨酸代琥珀酸，并在精氨酸代琥珀酸裂解酶(Argininosuccinatelyase, ASL)的作用下进一步反应，裂解生成精氨酸和延胡索酸。最后，精氨酸酶催化精氨酸水解生成尿素和鸟氨酸。尿素被人体代谢排出体外，而鸟氨酸则重新进入线粒体，参与下一轮循环。

尿素循环具有重要的生理功能，首先尿素循环是生物体排出体内多余氨类毒素最重要的途径，尿素循环可以将有毒的氨类物质转变为无毒的尿素排出到体外。其次，尿素循环的多种中间产物可以参与体内多种生理生化反应，如鸟氨酸是亚精胺和精胺等多胺合成的关键原料。当尿素循环发生失调时，氨基酸会大量积累，引发氨中毒，并进一步导致急性脑病变、慢性神经学疾病和Arginase缺乏症等多种疾病的发生。

参考文献：

[1]Mian A et al. Trends Mol Med. 2002;8(12):583-589.

图2.SIRT4调控OTC活性和尿素循环过程

图S2.SIRT4降低CP-K水平

图S3.SIRT4调节尿素循环过程

3、SIRT4促进OTC^CP-K307的去CP-K修饰

为了进一步探究OTC和SIRT4的关系，研究人员通过质谱鉴定出OTC主要的CP-K修饰位点，并经人工修饰获得第307位赖氨酸氨甲酰化的OTC（OTC^CP-K307）后进行质谱分析。其结果与HepG2细胞的胰蛋白酶OTC肽（图3A）和小鼠肝脏的胰蛋白酶OTC肽库（图S4A）的谱图相匹配，证实了OTC第307位赖氨酸是其氨甲酰化位点。

研究人员将CP与包含未修饰K307位点与突变后（OTCK307R赖氨酸转换为精氨酸）的OTC肽段进行孵育（图S4B），然后使用OTC^CP-K307位点特异性抗体处理孵育产物（图S4C），发现OTC^CP-K307水平升高，而OTC^CP-K307R突变体的OTC^CP-K307水平没有发生变化（图S4D）。在细胞实验中，研究人员在293T细胞和小鼠肝原代细胞的培养基中添加CP，结果发现两种细胞OTC^CP-K307过表达水平和内源性OTC水平均上调（图S4E、图3B）。这些结果说明OTCK307位点在体内和体外均发生了氨甲酰化。

有文献报道，只有SIRT4能够以NAD+依赖的方式对OTC进行去CP-K修饰，而SIRT3、SIRT5和失去催化活性的SIRT4H161Y突变均不能催化OTC的去CP-K修饰（图3C、图S5A）。用SIRT4处理合成的OTC^CP-K307肽后，通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)检测生成的脱氨基化肽（图3D、图S5B），同时通过斑点印迹法对OTC^CP-K307水平定量（图3E），发现SIRT4具有脱氨基化酶活性。研究人员猜想SIRT4催化OTC去CP-K机制可能与其脱乙酰基的方式类似（图3F），且随后发现的小鼠肝脏细胞中的内源性OTC和293T细胞中异位表达的OTC均与SIRT4存在相互作用，进一步证实了SIRT4的去CP-K酶活性（图S5C、D）。

接下来研究人员检测OTC^CP-K307去CP-K化产物OTC^K307水平，来对SIRT4的去CP-K酶活性进行定量（图S5B），SIRT4时间依赖性地催化OTC^CP-K307去CP-K修饰和其他酰胺键修饰，例如脂酰和HMG修饰等，但SIRT4催化的去乙酰化修饰效率非常低（图3G）（小编注：目前研究发现，相比较家族其他成员，虽然在结构上具有一定相似性，但SIRT4脱乙酰基活性较低甚至几乎没有，反而具有很强的ADP-核糖基转移酶活性），而SIRT4催化的去CP-K修饰催化效率(Kcat/Km)高达6.93，明显高于其他催化反应（图3H），这说明SIRT4具有高效的去CP-K酶活性。

图3.SIRT4促进OTCCP-K307去CP-K修饰

图S4.OTCK307位点发生氨乙酰化修饰

图S5.SIRT4去除OTCCP-K307的CP-K修饰

4、OTC^K307位点氨基甲酰化激活OTC

OTC^K307位点靠近OTC活性口袋，而活性口袋是OTC与CP结合的位置，因此OTC^K307为OTC发生CP-K修饰提供了结构基础（图4A）。此外，K307及其周边氨基酸在生物进化过程中较为保守，从秀丽隐杆线虫到人类中序列均相似（图4B），这说明K307对OTC发挥作用至关重要。研究人员将OTC的K307替换为不可发生氨甲酰化的精氨酸(OTC^K307R)，在保留该位点的正电荷的同时降低了OTC的特异性活性（图4C），然后使用不含CP的培养基处理细胞，发现OTC^K307R的氨甲酰化水平和特异性活性显著降低，（图4D、E），表明CP-K307是激活OTC的主要氨甲酰化位点。研究人员分别在有无谷氨酰胺或总氨基酸缺乏的培养基中培养HEK293T细胞，从中获得氨基甲酰化程度不同的OTC，结果发现从细胞氨基酸充足状态下获得的高氨基甲酰化OTC特异性活性较高，而细胞处于氨基酸饥饿状态下的低氨基甲酰化OTC特异性活性较低（小编注：作者测量OTC对底物反应产生瓜氨酸的相对活性来代表OTC的特异性活性），此外不同营养条件下的OTCK307R的OTC活性没有差异（图4F）。不仅如此，研究人员还添加了SIRT3、SIRT4和SIRT5孵育293T细胞，发现SIRT4处理降低了OTC^K307位点的氨甲酰化修饰水平，抑制了OTC活性（图4G），这与SIRT4过表达的结果一致，即降低了细胞中OTC^CP-K307水平和OTC活性（图4H），而SIRT3和SIRT5孵育细胞并不会抑制OTC活性，综上说明SIRT4是OTC^CP-K307的去CP-K修饰酶，同时OTC^CP-K307位点的活化会激活OTC（小编注：作者将OTC分离纯化出来，加入OTC底物CP，通过测定反应产物瓜氨酸生成速率来测定OTC活性）。

随着鸟氨酸浓度增加，OTC、OTC^K307R活性变化均产生双曲OTC动力学曲线（图4I），说明鸟氨酸是OTC的底物，此外，OTC活性随着CP的增加呈现S型曲线，OTC^K307R活性随着CP的增加呈双曲线增加（图4J）。OTC^K307R活性与CP浓度之间呈线性关系，而OTC活性与CP浓度之间并非线性关系（图4K）。这些结果表明，CP除了作为OTC底物外，还可以通过K307位点活化OTC。

图4.SIRT4去除OTCCP-K307以灭活OTC

5、SIRT4通过对OTC去CP-K修饰抑制尿素循环

小鼠肝脏和HepG2细胞中缺失SIRT4均上调尿素循环中间体水平（图2D、5A、图S3B-G）。与WT小鼠相比，Sirt4 ^{- / -}小鼠肝细胞的培养液中尿素水平升高，细胞内氨水平降低（图5B、C）。研究人员使用15N对NH4进行标记，然后分析了小鼠肝脏和HepG2细胞中15N标记的尿素循环过程（图S6A），证明了增加的尿素循环中间体确实来自氨。此外，Sirt4 ^{- / -}小鼠肝脏（图5D）及分离的肝细胞（图S6B）中15N标记的尿素循环中间体和尿素的百分比均高于WT小鼠，这些结果表明Sirt4缺失会上调尿素循环，从而促进氨的去除。

接下来，研究人员使用siRNA靶向WT和Sirt4 ^{- / -}小鼠肝脏细胞的OTC 3'-UTR，从而降低细胞内OTC表达。与WT组相比，Sirt4 ^{- / -}小鼠肝脏细胞中氨含量减少同时尿素水平增加，而在OTC下调后，尿素产量明显降低，细胞内氨积累增多（图5E、F），这说明siRNA处理能够消除Sirt4缺失带来的影响。过表达OTC后，OTC^K307R小鼠肝细胞中氨水平降低同时尿素水平升高，而OTC K307位点未突变小鼠肝细胞中氨的降低和尿素水平升高更为明显（图5G、H）。这些结果表明SIRT4通过对OTC^K307去CP-K修饰，降低OTC活性，进而抑制尿素循环。

图5.SIRT4去除OTCCP-K307以抑制尿素循环过程

图S6.GCN2 - eIF2α-ATF4信号通路调节SIRT4和尿素循环过程

5、SIRT4水平受到细胞内氨基酸水平调控

SIRT4通过尿素循环调节细胞去除氨，因此研究人员探究了SIRT4水平是否受细胞内氨基酸的调节。在培养基中补充氨基酸后，小鼠肝细胞中SIRT4水平下调，而补充氨或CP并不会改变细胞SIRT4水平（图6A）。与之相对的是，从培养基中去除谷氨酰胺或所有氨基酸会上调小鼠肝细胞中的SIRT4蛋白水平（图6B）。这些结果表明，氨基酸能够调控SIRT4的表达，并且当细胞处在谷氨酰胺或氨基酸饥饿状态下时，SIRT4的mRNA水平上调，但细胞处在葡萄糖饥饿下，SIRT4的mRNA水平不发生变化（图6C），这表明氨基酸饥饿会上调小鼠肝细胞SIRT4的基因表达水平，但是能量缺乏并不会改变细胞SIRT4的转录水平。

真核生物翻译起始因子2ct(Eukaryotictranslation initiation factor 2 alpha, elF2a)激酶一般对照非抑制性2激酶(General control nonderepressible 2, GCN2)是细胞感知氨基酸的传感器之一，接下来研究人员探究了GCN2是否能够调节SIRT4表达。研究人员对WT HepG2细胞和GCN2敲除的HepG2细胞进行氨基酸饥饿处理，结果发现氨基酸饥饿不会上调GCN2敲除的HepG2细胞的SIRT4蛋白（图6D）和mRNA（图6E）水平。但在WT HepG2细胞中，研究人员发现氨基酸饥饿上调GCN2的磷酸化水平进而激活GCN2，并且SIRT4水平也上调了，这说明氨基酸通过GCN2调节SIRT4的表达。GCN2-eIF2α-ATF4通路是细胞感应并传递氨基酸丰度的重要信号通路，而该信号通路中ATF4可以调控SIRT4的转录和表达，因此研究人员探究氨基酸是否通过GCN2-eIF2α-ATF4信号通路调控SIRT4的转录（图6F）。在使用siRNA沉默eIF2α和ATF4后，研究人员发现SIRT4转录水平（图S6C、D）和SIRT4蛋白水平（图6G、H）均下调，并且上述抑制作用不依赖于抑制Atf4的mTORC1活性（图6G）。此外，SIRT4 KO的HepG2细胞中对Eif2a和Atf4的沉默以及氨基酸饥饿均未上调小鼠肝细胞中的尿素和氨水平（图6I、J）。这些结果表明细胞通过GCN2-eIF2α-ATF4信号通路感知并传递氨基酸丰度信号，进而调控SIRT4的表达和尿素的生成。

图6.细胞在氨基酸剥夺状态下通过GCN2-eIF2α-ATF4信号通路上调SIRT4表达

7、SIRT4缺失上调尿素循环过程

研究人员发现与WT小鼠相比，Sirt4 ^{- / -}小鼠肝脏OTC^CP-K307水平升高（图7A），且Sirt4 ^{- / -}小鼠虽然摄食量（图S6E）和体重（图S6F）与WT小鼠相似，但饮水量和排尿量均增加（图S6G、图7B），并且Sirt4 ^{- / -}小鼠尿液中的尿素浓度与WT小鼠接近（图7C）。这些结果表明，Sirt4缺失促进尿素循环过程，提高了总尿素产量（图7D），导致NCD小鼠血氨水平降低（图7E）。此外，Sirt4缺失增加了小鼠体内OTC的特异性活性，但不影响其他尿素循环酶的活性（图7F），这进一步说明了SIRT4特异性对OTC进行去CP-K修饰使其失活（图5）。

图7.SIRT4缺失促进氨去除

8、抑制SIRT4可减轻肝性脑病

氨的低效清除会导致高血氨症并促进肝性脑病的发生，因此研究人员用CCl4处理WT和Sirt4 ^{- / -}小鼠，然后分析小鼠的代谢、行为和组织学特征（图S7A），以此来探究小鼠Sirt4敲除是否能够阻止肝毒素CCl4诱发的肝性脑病。在CCl4处理后，WT小鼠和Sirt4 ^{- / -}小鼠的食物摄入量（图S7B）和体重（图S7C）几乎没有差异，但Sirt4 ^{- / -}小鼠的饮水量和排尿量增多（图7G、H）。此外，WT和Sirt4 ^{- / -}小鼠的胆红素水平和丙氨酸氨基转移酶(Aspartate transaminase, AST)活性没有差异（小编注：胆红素水平和AST活性是确定肝脏损伤的重要指标），因此CCl4对WT和Sirt4 ^{- / -}小鼠肝脏的损伤程度相似。磁共振成像(MRI)显示，CCl4在WT和Sirt4 ^{- / -}小鼠中均诱发了脑水肿，而脑水肿是肝性脑病的组织学标志，其由星形胶质细胞肿胀引起。与WT小鼠相比，CCl4在Sirt4 ^{- / -}小鼠中诱导的脑水肿程度较轻(图7I和图S8)，这表明SIRT4敲除能够部分阻止由CCl4诱发的肝性脑病。与WT小鼠相比，未用CCl4处理和CCl4处理的Sirt4 ^{- / -}小鼠大脑中氨（图7J）和肝性脑病驱动谷氨酰胺（图7K）水平较低，这可能是Sirt4 ^{- / -}小鼠脑水肿较轻的原因。旷场（图7l、图S9A-C）和Y迷宫（图7M、图S9D-G）测试显示，在CCl4处理后，Sirt4 ^{- / -}小鼠表现出比WT小鼠更强烈的探索欲望和活动欲望。此外，CCl4处理后Sirt4 ^{- / -}小鼠尿素水平升高，血氨水平降低（图7N、O），综上表明与WT小鼠相比，Sirt4 ^{- / -}小鼠氨解毒能力更强，并且对CCl4诱导的脑水肿具有部分抵抗能力。

图S7.SIRT4的缺失改善肝性脑病

图S8.SIRT44缺失可阻止CCl4诱导的脑水肿

图S9.SIRT4缺失可阻止CCl4引起的小鼠探索欲望和活动力丧失

总结

本研究发现SIRT4作为一种脱氨基酶可以调控氨的产生和清除，当细胞缺乏氨基酸时，细胞通过GCN2-eIF2α-ATF4信号通路上调SIRT4表达，高表达的SIRT4促进OTCCP-K307的去CP-K修饰，导致OTC失活，进而抑制尿素循环过程。当细胞内氨基酸充足且氨基酸分解代谢被激活时，氨基酸促进OTC的CP-K修饰激活OTC进而上调尿素循环过程，同时通过GCN2-eIF2α-ATF4信号通路诱导SIRT4低表达，从而清除多余的氨，防止细胞氨中毒。这种反馈调节的机制既确保了氨基酸的细胞氮供应，又避免了细胞氨中毒，保证了细胞的氨稳态。此外，敲除SIRT4能够降低小鼠血氨水平，改善CCl4诱导的肝性脑病。综上所述，该研究发现SIRT4在调控细胞氨脱毒过程中的关键作用，为未来肝癌患者高血氨症和肝性脑病的治疗提供了新思路和潜在靶点。