敲黑板啦！

1. 年轻脂肪细胞抵抗胞浆mtRNA诱导的干扰素反应

2.抑制IRF7相关信号通路促进米色脂肪生物合成

3.维生素D抑制年轻脂肪细胞中IRF7的表达

4.出生后早期肥胖促进脂肪细胞中IRF7的表达

研究结果

1、β3-肾上腺素能受体激活产热脂肪细胞分泌锌离子

冷刺激能够引起交感神经兴奋，上调棕色脂肪(Brown Fat Tissue, BAT)和皮下白色脂肪组织（Subcutaneous White Adipose Tissue , scWAT）中UCP1的表达，使产热增加。研究人员将小鼠暴露于4℃环境2天后，发现BAT和scWAT中产热基因UCP1的表达和脂解基因激素敏感性甘油三酯脂肪酶(hormone-sensitive triglyceride lipase，HSL)的磷酸化水平均显著上调（图S1A）。通过检测交感神经元标记基因酪氨酸羟化酶（Tyrosine hydroxylase, TH）的表达水平，研究人员发现交感神经支配水平也明显上调（图S1A）。同时scWAT中免疫染色结果显示UCP1和TH表达水平均上调，且UCP1阳性细胞和TH阳性细胞的定位彼此相邻（图S1B）。虽然这一结果可以用交感神经元诱导米色脂肪细胞棕色化来解释，但米色脂肪细胞是否也能诱导交感神经支配尚不清楚。因此，研究人员将携带白喉毒素受体（diphtheria toxin receptor, DTR）的小鼠与UCP1-Cre的小鼠杂交，构建出Ucp1-DTR小鼠。在Ucp1-DTR小鼠中，通过注射无毒剂量的白喉毒素（diphtheria toxin, DT）专门破坏Ucp1阳性产热细胞，可模拟BAT和米色脂肪细胞去除的情况。与注射PBS的Ucp1-DTR小鼠相比，注射白喉毒素的Ucp1-DTR小鼠的BAT和scWAT表现出白色化形态（图S1C），并且在冷暴露条件下，BAT和scWAT中Ucp1的表达水平显著下调。这表明BAT和scWAT中的Ucp1阳性的产热脂肪细胞被成功清除（图1A和图S1D）。有趣的是，研究人员发现注射白喉毒素的Ucp1-DTR小鼠BAT和scWAT的交感神经支配也减少了（图1A和1B和图S1D和图S1E），但肾脏和心脏中的交感神经支配并没有发生显著变化，因此研究人员认为BAT和scWAT中交感神经支配的减少不是由于交感神经元中Ucp1-Cre的表达引起的（图S1D）。脂肪细胞上的β3-肾上腺素能受体（beta3-adrenoceptor, β3AR）介导了交感神经元诱导的脂肪细胞产热，研究人员在BAT和scWAT中局部注射β3AR选择性拮抗剂L748337，发现UCP1表达降低（图1C和图S1F），同时，BAT和scWAT的交感神经支配也减少了（图1C和图1D和图S1F和图S1G）。这些结果与先前的研究一致，表明产热脂肪细胞在冷暴露后可诱导交感神经支配。为了进一步证明这一观点，研究人员将来自scWAT的SVF分化为成熟的米色脂肪细胞或白色脂肪细胞，并用β3AR激动剂CL316243处理，分别收集这两组细胞的的培养基上清液，用来处理初级交感神经元。结果发现，与未用培养基上清液处理的神经元相比，使用来自CL316243刺激后米色脂肪细胞的培养基上清液处理的神经元神经突生长的长度增加（图1E），然而来自CL316243刺激的白色脂肪细胞的培养基上清液处理的神经元神经突生长的长度则没有明显变化，这说明产热脂肪细胞通过分泌因子来促进交感神经支配。据报道，多种蛋白质和脂质因子可以介导脂肪细胞和交感神经元之间的交流，但是离子是否也能介导这种效应尚不清楚。实际上当CL316243刺激的米色脂肪细胞的培养基上清液被BSA或EDTA（小编注：BSA牛血清蛋白可以与缓冲液或培养基中常见的多种阳离子、阴离子结合，EDTA可以与钙离子、镁离子、铅离子等多种金属阳离子（多为2价离子）形成螯合物。两者结合的离子种类以及与离子的亲和度存在差异）预处理以去除初级离子时，培养基上清液对神经元的促进作用被消除（图1F）。为了确定介导这种效应的特异性离子，研究人员对CL316243刺激的米色脂肪细胞的培养基上清液进行了离子质谱分析，结果发现Zn是培养基上清液中上调水平最高的离子（图1G），然后研究人员比较了米色脂肪细胞与已知富含锌的细胞（如谷氨酸能神经元和胰腺细胞）中锌的水平，发现米色脂肪细胞中的锌含量约为谷氨酸能神经元和胰腺细胞中锌含量的三分之一，这提示米色脂肪细胞含有大量的锌（图S1H）。此外，当SVF向米色脂肪细胞或棕色脂肪细胞分化时，细胞内Zn水平逐渐升高（图1H），并且CL316243刺激的米色脂肪细胞培养基上清液中锌水平升高，但CL316243刺激的白色脂肪细胞培养基上清液中锌水平没有升高（图1I）。研究人员分别从暴露于室温（25℃）和寒冷环境（4℃）的小鼠中收集scWAT的间质组织液（小编注： scWAT过滤后离心取得）并测定锌水平，结果发现在冷暴露条件下小鼠的scWAT细胞外液中锌水平也有所上调（图1J），但小鼠血清中锌水平在室温或冷暴露下保持不变，因此这种增加只是局部增加（图1J）。接下来，研究人员探究了β3AR诱导米色脂肪细胞分泌锌的机制，β3AR是一种Gs蛋白偶联受体，可激活G蛋白相关激酶、蛋白激酶A（PKA）和被cAMP激活的交换蛋白（Exchange protein activated by cAMP, EPAC）。当用CL316243处理的米色脂肪细胞分别用PKA抑制剂H89、G蛋白相关激酶抑制剂CCG215022或EPAC抑制剂ESI-09处理后，结果发现仅H89处理减弱了CL316243刺激下米色脂肪细胞释放的锌水平，表明PKA对米色脂肪细胞中β3AR诱导的锌分泌至关重要（图1K）。细胞内的锌主要储存在内质网、溶酶体和线粒体等细胞器中，通过转运并释放在细胞质中发挥细胞内功能。与白色脂肪细胞相比，米色脂肪细胞富含较多的线粒体，因此研究人员认为β3AR的激活可能诱导线粒体释放锌。据报道，PKA诱导线粒体膜去极化并从线粒体中释放钙，因此线粒体可能通过类似的机制来释放锌。实验结果表明，CL316243或碳基氰化物4-（三氟甲氧基）苯肼（Carbonyl cyanide-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone, FCCP）能够诱导线粒体膜去极化，降低Zn与线粒体的共定位，而H89预处理阻断了这一作用（图1L）。此外，由于线粒体通透性过渡孔复合体是一种在线粒体膜去极化中至关重要的电压依赖性多组分蛋白，作者用环孢素A（Ciclosporin A, CsA）阻断线粒体通透性过渡孔复合物，消除CL316243诱导的线粒体膜去极化，发现其可以同时恢复Zn与线粒体的共定位（图1L）。结果表明，与CsA和CL316243共同处理的米色脂肪细胞培养基上清液中锌水平降低（图1M）。SLC30A1（Zinc transporter 1, ZnT1）是介导锌从细胞质流出到细胞外空间的重要转运体，为了进一步证实CL316243处理后细胞外锌的上调是由线粒体将锌释放到细胞质，再由细胞质排出到细胞外这一过程所引起的，研究人员使用siRNA（siSLC30A1）沉默米色脂肪细胞中SLC30A1的表达，再用CL316243刺激细胞，结果发现转染siSLC30A1的细胞中CL316243刺激的锌释放减少（图1N）。这些结果表明，β3AR激活PKA诱导线粒体膜去极化，导致锌从线粒体连续释放到细胞质和细胞外空间。

图1.ucp1阳性的产热脂肪细胞被β3-肾上腺素能受体激活后分泌锌

图S1.Ucp1阳性细胞和TH阳性细胞的相互调控

2、锌促进交感神经支配和脂肪细胞产热

冷刺激研究人员直接用锌处理初级交感神经元，发现锌促进这些细胞的神经突生长（图2A）。通过钙成像检测发现锌处理也增加了初级交感神经元的兴奋性（图2B）。然而，用锌处理原代米色脂肪细胞时，产热基因的表达并未受到影响（图S2A），这些结果表明锌主要通过刺激交感神经元影响产热（小编注：这里由于产热基因未受到影响，结合前文中图2A和2B对应结果。作者在这里排除了对脂肪细胞产热基因表达的直接影响，从而说明产生的锌离子主要是通过交感神经的相关调控影响产热。后续内容便证实了这一观点，相关内容已在后文说明）。当给小鼠腹腔注射锌时，scWAT和BAT中的交感神经支配以及scWAT中的去甲肾上腺素水平均增加（图2C和图2D和图S2B）。相反的是，在scWAT和BAT中局部注射Zn螯合剂TPEN，并将其置于冷暴露条件下，结果发现scWAT的交感神经支配和去甲肾上腺素水平下降（图2E和图2F和图S2C）。这些结果表明，锌在体内外均能促进交感神经支配。据报道，神经生长因子（Nerve growth factor, NGF）激活细胞外调节蛋白激酶(Extracellular regulated protein kinases, ERK)和蛋白激酶B(AKT)可促进交感神经元的神经突生长。研究人员发现NGF在初级交感神经元中激活了ERK和AKT，然而Zn刺激初级交感神经元只能激活ERK而无法激活AKT（图2G）。此外，使用ERK抑制剂FR180204处理神经元细胞将会消除Zn对神经突生长的促进作用（图2H），这说明Zn通过ERK来刺激交感神经支配。据报道，ZIP12（Zinc transporter family member 12, SLC39A12）是神经元分化所必需的一种蛋白，其能够促进神经元的轴突生长。为了验证ZIP12是否也有助于Zn刺激的初级交感神经元神经突的生长，研究人员用ZIP12 shRNA转染细胞，以沉默ZIP12表达（图S2D）。结果发现，ZIP12沉默后锌对神经突起生长的促进作用显著降低（图2I），这一结果表明，ZIP12对锌刺激的神经突起生长至关重要。接下来研究人员还发现沉默ZIP12会抑制Zn刺激的神经突生长（图2I），然而当ERK的激活被FR180204抑制时，沉默ZIP12的表达并不能导致Zn刺激的神经突生长进一步减少（图2J），因此，ZIP12介导的交感神经元锌内流刺激了ERK的激活和神经突的生长。

接下来，研究人员进一步研究了锌给药对产热的影响。结果发现，给小鼠腹腔注射不同剂量（10 mg、30 mg和50mg/kg）锌并进行全身间接热量分析时，小鼠的氧气消耗量呈剂量依赖性增加（图2K），但体重没有显著变化（图S2E)。研究人员给小鼠腹腔注射Zn（每公斤体重30mg），结果发现尽管摄食量和活动量没有发生变化，但注射锌的小鼠肩胛骨间温度升高（图2L和图S2FA和图S2G），并且scWAT和BAT中产热基因表达、UCP1和HSL的磷酸化水平均上调（小编注：脂肪组织是分泌锌离子的部位，而不是锌离子的作用靶点。棕色、米色脂肪细胞分泌的锌促进交感神经支配，交感神经进而刺激脂肪细胞产热，即锌离子促进脂肪细胞产热是依赖于交感神经元而不是脂肪细胞。因此锌处理不影响原代脂肪细胞的产热基因表达，但给小鼠腹腔注射锌离子后，锌离子可以通过增加交感神经支配上调产热基因表达促进能量消耗）（图2M-O和图S2H-J）。相反，在scWAT和BAT中局部注射锌螯合剂TPEN可导致小鼠耗氧量下降，但对体重、摄食量和活动量没有影响（图2P和图S2K-M），在冷暴露环境下，scWAT和BAT中局部注射锌螯合剂TPEN的小鼠产热基因表达、UCP1蛋白和HSL的磷酸化水平均降低（图2Q-S和图S2N-P）。为了进一步证明Zn发挥功能是否依赖于Ucp1，研究人员使用Ucp1敲除（Ucp1 KO）小鼠进行腹腔注射Zn（每公斤体重30mg），发现与WT组相比，Zn处理不能上调Ucp1 KO小鼠的耗氧量（图S2Q），同时两组小鼠的体重、摄食量和活动量也没有差异（图S2R-T）。

图2.锌促进交感神经支配和脂肪细胞产热

图S2.锌促进BAT的产热作用

3、补充锌可以促进交感神经支配进而改善肥胖

已有研究发现补充锌可以减轻体重，但是其中的作用机制尚不清楚。于是，研究人员在发现米色脂肪细胞分泌的锌能够促进交感神经支配和产热后，进一步探讨了锌是否可以通过这一机制改善肥胖。通过在高脂肪饮食（HFD）小鼠的饮用水中添加锌，发现小鼠体重降低、scWAT和BAT重量减少和肝脂肪变性改善（图3A和图3B和图S3A）。虽然摄食量和活动量没有改变，但锌处理组小鼠的耗氧量显著上调（图3C和图S3B和图S3C），在scWAT和BAT中，UCP1和HSL的磷酸化水平上调（图3D和图3E）。为了证明锌的抗肥胖作用是由交感神经支配介导的，研究人员使用6-羟基多巴胺（6-Hydroxydopamine hydrobromide, 6-OHDA, 拥有较强的神经毒性）破坏锌处理组小鼠BAT和scWAT中的交感神经纤维，结果发现6-OHDA处理逆转了锌的抗肥胖作用（图3A-E和图S3B和图S3C）。此外，研究人员通过手术切断进入BAT和scWAT的神经纤维，这也消除了锌抑制肥胖和增加产热的效果（图3F和图3G）。这些结果证明了补充锌可以促进scWAT和BAT的交感神经支配进而改善肥胖。

图3.补充锌可通过促进交感神经支配来改善肥胖

图S3.锌治疗可以改善肥胖症

4、肥胖通过炎症诱导MT2表达来抑制锌的分泌

肥胖的特点是脂肪组织的慢性炎症和低能量消耗，而锌在肥胖的发展中发挥作用的分子机制需要进一步探究。研究人员发现在HFD喂养的小鼠BAT和scWAT中，交感神经支配和Zn水平均下调（图4A和图4B和图S4A）。与瘦个体相比，人类肥胖个体的scWAT样本的交感神经支配也减少（图4C）。研究人员认为肥胖条件下产热脂肪细胞数量的减少可以部分解释锌水平和交感神经支配的降低，但仍需探究锌水平的降低是否与锌在产热脂肪细胞中的分泌缺陷有关。因此研究人员筛选（小编注：作者查阅文献发现金属硫蛋白（MT）、Irt-样蛋白(ZIP)、锌转运蛋白(ZnT)是参与锌的流入、螯合、配位、释放和流出等过程最主要的蛋白质，并在此处引用了两篇介绍锌相关蛋白的综述）出重要的锌信号分子，包括锌转运体（ZnT(Zinc Transporter)和ZIP）以及金属硫蛋白-1（Recombinant Metallothionein 1, MT1）和MT2，金属硫蛋白是一种富含半胱氨酸且与锌亲和力极高的蛋白），研究人员比较了常规饮食（NCD）喂养和HFD喂养小鼠的scWAT 和 BAT 中的基因，发现MT2是上调幅度最大的基因（图4D和图S4B）此外，在人类肥胖个体的scWAT样本中，MT2表达增加，且scWAT中MT2 mRNA水平与BMI呈正相关（图4E和图4F和图S4C）。不仅如此，MT2的表达与肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）和白细胞介素-1β（Interleukin-1β,IL-1 β）等炎症基因也呈正相关，这些结果提示MT2的上调可能是肥胖诱导的巨噬细胞浸润和脂肪组织发生炎症引起的（图4G和图4H）。事实上，促炎细胞因子如IL-1β和TNF刺激还会上调原代米色脂肪细胞中MT2的表达水平（图4I）。当给NCD小鼠注射氯膦酸脂质体（Clodronate Liposomes, CLD）清除小鼠的巨噬细胞时，小鼠scWAT中的MT2 mRNA水平下调（图4J）。TNF和IL-1β能够激活下游IKK（inhibitor of kappa B kinase）、ERK、p38和JNK(Jun N-terminal kinase)等激酶，因此研究人员使用BMS-345541（IKK抑制剂）、SCH772984（ERK抑制剂）、SB202190（p38抑制剂）和SP600125（JNK抑制剂）对原代米色脂肪细胞进行预处理，发现ERK抑制剂SCH772984特异性抑制TNF刺激的MT2表达（图4K），这提示炎症细胞因子通过ERK刺激MT2的表达，同时，研究人员还发现TNF和IL-1β可以刺激ZIP1、ZIP6、ZIP8和ZIP14的表达，而ZIP1、ZIP6、ZIP8和ZIP14是Zn内流的重要转运体（图S4D），这些锌转运体介导的锌离子内流会刺激MT2表达。为了排除内流的锌离子对MT2表达水平的影响，（请润色），研究人员用基础培养基（通常不含锌）或额外添加锌的培养基培养原代米色脂肪细胞，再用TNF刺激细胞，结果发现，与含锌的培养基相比，无锌培养基下调了TNF刺激的MT2的表达水平（图4L）。这些结果表明，细胞因子激活ERK和ZIP介导的Zn内流同时增加了脂肪组织中MT2的表达，而MT2作为细胞内锌储库，限制游离锌的含量。与WT小鼠相比，MT2-KO小鼠的scWAT细胞外液中的Zn浓度增加，而局部注射腺病毒的Ad-MT2小鼠Zn浓度降低（图4M和图4N）。此外，MT2-KO小鼠的原代米色脂肪细胞受CL316243刺激后的培养基中锌的分泌水平也发生上调（图4O）。

图4.肥胖通过炎症诱导的MT2表达来抑制锌的分泌

图S4.肥胖通过炎症诱导MT2的表达

5、MT2抑制交感神经支配和细胞产热

接下来，研究人员通过脂联素-Cre小鼠和Mt2fl/fl小鼠交配，获得脂肪组织特异性MT2敲除（Mt2 AKO）小鼠来探究MT2是否是肥胖诱导的交感神经支配和抑制产热的原因。研究人员从WT和Mt2 AKO小鼠中提取原代米色脂肪细胞，并用CL316243处理，结果发现与CL316243处理的WT米色脂肪细胞培养基相比，CL316243处理的Mt2 AKO米色脂肪细胞培养基进一步促进了初级交感神经元突起的生长（图5A），用Zn螯合剂TPEN预处理则会消除这种效应，表明米色脂肪细胞中MT2的表达对Zn调节交感神经支配至关重要（图5A）。研究人员还发现Mt2 AKO小鼠的scWAT和BAT中交感神经支配增加了，但是Mt2 AKO小鼠的心脏中交感神经支配没有发生变化（图5B和图S5A和图S5B）。此外，与WT小鼠相比，Mt2 AKO小鼠的scWAT和BAT中耗氧量、产热基因表达水平和UCP1蛋白水平均增加（图5C-E和图S5C和图S5D），但体重、摄食量和活动量没有变化（图S5E-G）。重要的是，在Mt2 AKO小鼠和WT小鼠的原代米色脂肪细胞中产热基因的表达没有发生变化，因此可以初步确定scWAT内源性Mt2不会影响米色脂肪细胞的功能（图S5H）。为了验证Mt2缺陷表型依赖于scWAT和BAT的交感神经支配，研究人员通过手术去除Mt2 AKO小鼠和WT小鼠的BAT和scWAT的神经纤维，发现这两种基因型之间的差异被消除（图5F和图5G和图S5I-K）。为了进一步确定脂肪组织特异性MT2敲除所带来的影响，研究人员将来自Mt2 KO小鼠和WT小鼠的米色脂肪细胞分别移植回WT小鼠体内，结果发现虽然WT米色脂肪细胞移植（Trans-WT）小鼠和Mt2 KO细胞移植（Trans-KO）小鼠的体重和摄食量没有变化，但与Trans-WT小鼠相比，Trans-KO小鼠局部交感神经支配（图S5N）和耗氧量均显著上调（图S5O）。同时，两组间内源性scWAT和BAT中的产热基因表达量没有差异（图S5P和图S5Q）。

接下来，研究人员使用Ad-GFP和Ad-MT2腺病毒载体感染米色脂肪细胞，然后用收集的培养基处理神经元，结果发现与来自Ad-GFP感染的米色脂肪细胞培养基相比，Ad-MT2感染的米色脂肪细胞培养基抑制了神经突的生长长度，而TPEN处理则会减弱这种抑制作用（图5H）。最后，研究人员在scWAT和BAT中局部注射Ad-GFP或Ad-MT2，发现局部注射Ad-MT2后，MT2在scWAT和BAT中表达量上调近8倍，但在肝脏或肾脏中表达量没有变化（图S5R）。并且研究人员证实了Ad-MT2感染了脂肪细胞，而没有感染交感神经元（图S5S）。此外，在BAT和scWAT中过表达MT2会导致交感神经支配、耗氧量、产热基因表达量减少，但不改变体重、摄食量和活动量（图5I-M和图S5T-Z）。这些结果表明，肥胖诱导的BAT和scWAT中MT2的上调可进一步导致锌水平、交感神经支配和产热作用的降低。