代谢学人

Nature Aging：m6A解开衰老之谜！

撰文 | 刘梓棋 郑宇含 张婷 李雨

编辑 | 孟美瑶

校对 | 张彦康

背景介绍

衰老是人类机体组织功能失衡和各种慢性疾病发生发展的主要危险因素，例如，随着年龄的增长，肝脏和骨骼肌的代谢稳态发生紊乱、炎症反应和细胞凋亡水平增加，进而促进了肝脏脂质变性和肌肉萎缩现象的发生。此外，与衰老相关的心脏功能障碍如心脏能量代谢障碍，被认为是引起心室肥厚和心力衰竭的主要因素。灵长类动物在遗传和生理上与人类比较接近，是研究人类衰老相关疾病的理想动物模型。因此，利用灵长类动物模型深入了解衰老相关组织功能稳态，对于治疗人类衰老相关疾病至关重要。 

m⁶A修饰是指RNA腺嘌呤第6号位的氮发生的甲基化修饰，形成甲基化的腺苷酸。m⁶A是mRNA中最常见的修饰之一，在调节基因表达、剪接、RNA稳定性、mRNA降解等环节发挥重要作用。m⁶A是一种动态可逆的转录后修饰，其功能主要由RNA甲基转移酶（writer）、RNA去甲基化酶（eraser）和m⁶A特异结合蛋白（reader）决定。m⁶A甲基转移酶主要负责催化腺苷酸的甲基化，包括METTL3、METTL14、WTAP、RBM15等。m⁶A去甲基化酶负责甲基化的“擦除”，即去甲基化，包括FTO、ALKBH5、ALKBH3等。在RNA甲基转移酶和RNA去甲基化酶的协同合作下，RNA的m⁶A修饰水平得以实现动态调控。而m⁶A特异结合蛋白负责识别m⁶A位点并影响mRNA剪接、mRNA结构、mRNA翻译效率以及稳定性，这类蛋白包括含有YTH结构域的蛋白质（如YTHDF1/2/3、YTHDC1/2）、异质核糖核蛋白（HNRNPC、HNRNPG、HNRNPA2B1等）和IGF2BPs。

目前有研究发现，m⁶A水平在衰老相关神经退行性疾病发生发展中发挥着重要作用。例如有研究发现在PD（帕金森疾病，一种常见的与衰老相关的神经系统疾病）小鼠纹状体中m⁶A修饰水平整体下调，进一步研究表明m⁶A的减少可诱导NMDA（N-甲基-d-天冬氨酸）受体1的表达，促进氧化应激，从而导致多巴胺能神经元的凋亡，促进帕金森疾病的发生发展；也有研究在AD（阿尔兹海默症）小鼠模型中发现皮质和海马中m⁶A水平整体升高，对m⁶A差异化基因进行通路富集分析显示其主要与突触生长发育相关，提示m⁶A RNA修饰参与了AD的发生发展过程。这些研究为探究m⁶A在维持衰老组织稳态的潜在功能和机制提供了理论依据。然而，灵长类动物组织在生理衰老过程中其m⁶A表观转录组的动态变化还未被表征。

因此，在本项研究中，研究人员结合m⁶A-seq和RNA-seq技术描述了年轻和衰老灵长类动物肝脏、心脏和骨骼肌中与年龄相关的m⁶A表观转录组动态变化，揭示了m⁶A修饰与基因表达之间的联系，并发现了在衰老过程中，与心脏和肝脏相比，骨骼肌m⁶A水平下调最为显著，进一步分析确定了METTL3-m⁶A-NPNT轴在维持衰老骨骼肌稳态中发挥着潜在保护作用。总之，该研究揭示了衰老灵长类动物肝脏、心脏和骨骼肌中动态m⁶A水平变化模式，这为未来开发基于m⁶A的治疗手段来缓解骨骼肌萎缩和其他衰老相关疾病提供了理论基础。

1. 灵长类动物组织中的m⁶A图谱

研究人员收集了8只年轻食蟹猴（4-6岁，相当于人类20岁）和8只年老食蟹猴（18-21岁，相当于人类70岁）的肝脏、心脏和骨骼肌样本，表型检测结果显示与年轻食蟹猴相比，衰老食蟹猴的肝脏、心脏和骨骼肌中脂质积累明显增加，SASP（衰老相关分泌表型）相关基因表达增加以及lamin B1蛋白（核纤层蛋白B1，细胞衰老标志蛋白）水平下降（Fig. 1b,c and Extended Data Fig. 1a）。此外，研究人员还发现与年轻食蟹猴相比，衰老食蟹猴骨骼肌纤维横截面积减少，心脏肌纤维横截面积增加（Fig. 1d,e），这与患衰老相关疾病患者的骨骼肌萎缩和心肌肥大的病理特征一致。在衰老食蟹猴骨骼肌中也检测到活化的caspase-3（cleaved caspase-3）蛋白水平显著升高，这表明衰老过程中骨骼肌细胞凋亡水平增加（Fig. 1f）。总之，这些结果表明灵长类动物在衰老过程中肝脏、心脏和骨骼肌的代谢稳态失衡。

随后，研究人员对年轻食蟹猴和衰老食蟹猴的肝脏、心脏和骨骼肌组织进行m⁶A seq和RNA seq检测，以描述衰老过程中m⁶A修饰的变化（Fig. 1a）。与先前研究一致的是，在肝脏、心脏和骨骼肌组织中都存在m⁶A共识序列（如高度富集的GGACU），且显著富集在终止密码子附近（小编注：目前研究发现m⁶A修饰有富集在起始密码子附近、终止密码子附近以及CDS中长的外显子序列中，目前看到的研究主要在终止密码子附近富集的较多）（Extended Data Fig. 1c）。m⁶A修饰在肝脏、心脏和骨骼肌中整体分布模式相似（Extended Data Fig. 1c）。而在年轻和衰老的肝脏、心脏和骨骼肌样本中，研究人员均发现心脏和骨骼肌的m⁶A修饰和转录特征更为相似，这一现象与心脏和骨骼肌的组织形态和功能更相似有关 （Fig. 2a and Extended Data Fig. 1d–f）。

在年轻和衰老食蟹猴的肝脏、心脏和骨骼肌样本中，研究人员分别发现了超过25000个m⁶A峰（以下简称m⁶As），而三种组织共同富含超过16000个m⁶As （Fig. 2b and Extended Data Fig. 1g）。对三种组织共同富含m⁶As的mRNA进行通路富集分析，发现年轻和衰老组织均主要富集在共价染色质修饰、自噬和RNA代谢相关途径。此外，研究人员对年轻和衰老食蟹猴的肝脏、心脏和骨骼肌特异性富含的m⁶A修饰mRNA进行通路富集分析，发现肝脏特异性m⁶A修饰主要富集在脂质代谢途径，心脏特异性m⁶A修饰主要富集在心脏发育途径，而骨骼肌特异性m⁶A修饰主要富集在肌肉结构发育途径，且这一现象与年龄无关（Fig. 2d,e and Extended Data Fig. 1i）。总之，这些结果表明m⁶A广泛存在于灵长类动物的肝脏、心脏和骨骼肌组织中，且表现出高度组织特异性，而这一现象与年龄无关。 为了研究m⁶A修饰与基因表达之间的联系，研究人员检测了m⁶A mRNA的表达水平和表达差异性，发现三种组织共同富含的m⁶A mRNA表现出更高的表达水平和更低的表达差异，而具有组织特异性的m⁶A mRNA在年轻和衰老组织中表达差异性更高（Fig. 2f,g and Extended Data Fig. 1j,k），这些结果表明三种组织共同富含的m⁶A在组织中具有更高和更稳定的基因表达模式，这可能在维持组织基本功能中发挥着关键作用，而组织特异性的m⁶A修饰可能在维持组织特异性功能方面发挥调节作用。

图1：年轻和衰老食蟹猴中肝脏、心脏和骨骼肌衰老相关表型

图2：灵长类动物肝脏、心脏和骨骼肌中m⁶A表观转录组分析

辅图1：年轻和年老灵长类动物肝脏、心脏和骨骼肌中的 m⁶A修饰

2. 衰老过程中灵长类动物组织中m⁶A变化

为了研究m⁶A表观转录组与衰老之间的联系，研究人员将年轻和衰老食蟹猴的三种组织中m⁶As分为3类：在年轻和衰老组织中都存在的m⁶As定义为衰老稳定m⁶As（aging stable m⁶As）；在年轻组织中存在而在衰老组织中消失的m⁶As定义为衰老丢失m⁶As（old-loss m⁶As）；在年轻组织中不存在而在衰老组织中被检测到的m⁶As定义为衰老获得m⁶As（old-gain m⁶As）（Extended Data Fig. 2a）。结果显示大多数衰老稳定m⁶As均存在于肝脏、心脏和骨骼肌中，而衰老获得m⁶As和衰老丢失m⁶As则表现出明显的组织特异性（Extended Data Fig. 2b）。接下来，为了揭示衰老过程中灵长类动物组织中m⁶A修饰的改变与基因表达变化之间的联系，研究人员检测了衰老食蟹猴的肝脏、心脏和骨骼肌中衰老损失m⁶A mRNA、衰老获得m⁶A mRNA和衰老稳定m⁶A mRNA的表达水平和表达差异性，发现在三种组织中，与衰老稳定m⁶A mRNA相比，衰老获得m⁶A mRNA和衰老丢失m⁶A mRNA的表达水平更低，且表达差异性更高 （Fig. 3a,b and Extended Data Fig. 2c,d）。随后，研究人员探究了衰老获得m⁶A mRNA和衰老丢失m⁶A mRNA的基因表达变化，发现m⁶A修饰水平的变化与基因表达水平呈正相关关系，例如：在骨骼肌中衰老丢失m⁶A mRNA的表达水平显著降低，而心脏中衰老获得m⁶A mRNA的表达水平显著升高（Extended Data Fig. 3a–c）。 

接下来，为了探究肝脏、心脏和骨骼肌组织中衰老获得m⁶A和衰老丢失m⁶A所发挥的功能，研究人员对三种组织中衰老获得m⁶A mRNA和衰老丢失m⁶A mRNA进行通路富集分析，结果显示心脏和骨骼肌中衰老获得m⁶A mRNA主要富集在代谢相关途径中，而肝脏中衰老获得m⁶A mRNA主要富集在免疫相关途径中，如免疫调控作用、T细胞增殖和白细胞分化途径（Fig. 3c,d）；此外，在肝脏和骨骼肌中衰老丢失m⁶A mRNA主要富集在细胞周期、脂代谢和蛋白定位相关途径中，而心脏中衰老丢失m⁶A mRNA高度富集在糖代谢和RNA加工相关途径中（Fig. 3c,d）。相比之下，衰老稳定m⁶A mRNA在肝脏、心脏和骨骼肌中均高度富集在染色质共价修饰、分解代谢途径和自噬途径中（Fig. 3c,d），表明衰老稳定m⁶As在维持代谢组织基本功能方面发挥重要作用。总之，这些结果表明m⁶A修饰除了维持组织基本功能外，在衰老过程中特异获得或丢失的m⁶A修饰可调控代谢组织的特异性功能。

图3：衰老过程中灵长类动物肝脏、心脏和骨骼肌中m⁶A动态变化

辅图2：衰老过程中灵长类动物组织中m⁶A 修饰与基因表达的关系

图3：肝脏、骨骼肌和心脏中编码衰老丢失m⁶A mRNA和衰老获得m⁶A mRNA基因的表达变化

3. METTL3表达下调促进骨骼肌衰老

目前研究结果表明衰老过程中m⁶A修饰水平的改变介导了代谢组织特异性功能变化，接下来研究人员想要进一步探究m⁶A修饰水平变化是否调控了灵长类动物组织在衰老过程中代谢失衡现象及其分子机制。首先研究人员检测了肝脏、心脏和骨骼肌组织中总m⁶A含量变化，发现与年轻食蟹猴相比，衰老食蟹猴骨骼肌中总m⁶A含量显著下降，而肝脏和心脏组织中总m⁶A含量无明显变化 （Fig. 4a, b and Extended Data Fig. 4a–d）。为了探究衰老骨骼肌组织总m⁶A含量的下降是否与m⁶A修饰相关酶的表达水平相关，研究人员检测了骨骼肌组织中m⁶A甲基转移酶和去甲基转移酶蛋白表达水平，发现与年轻骨骼肌组织相比，衰老骨骼肌组织中METTL3蛋白水平显著下降，而其他相关蛋白如METTL14、FTO和ALKBH5水平无明显变化 （Fig. 4c and Extended Data Fig. 4e），表明衰老骨骼肌中m⁶A修饰水平的下降可能是由骨骼肌中m⁶A甲基化转移酶METTL3表达水平降低所介导的，且这一现象是骨骼肌所特有的，因为在衰老肝脏和心脏中并没有检测到m⁶A修饰相关酶表达水平的变化（Extended Data Fig. 4f,g）。 

为了进一步证明METTL3是否介导了衰老骨骼肌m⁶A修饰水平的变化，研究人员利用CRISPR-Cas9技术体外构建了METTL3缺失的肌管 （Fig. 4d），发现与对照肌管相比，METTL3缺失显著降低了肌管中m⁶A含量，且肌管直径和细胞核数量显著减少，表明METTL3缺失导致肌细胞代谢稳态受损（Fig. 4e-g）。此外，METTL3缺失后肌管中β-半乳糖苷酶（SA-β-gal，衰老标志）活性显著增加，lamin B1蛋白表达下降，且P16、Ⅰ型干扰素相关基因以及SASP相关基因表达显著上调 （Fig. 4h-k），此外，研究人员还发现METTL3缺失后肌管凋亡水平增加（Fig. 4l），这与骨骼肌组织衰老表型结果一致，表明METTL3缺失可促进肌细胞衰老和凋亡。总之，这些结果表明在灵长类动物衰老过程中，METTL3在维持骨骼肌功能方面发挥着至关重要的作用。

图4：衰老过程中METTL3表达和m⁶A水平下调促进骨骼肌功能紊乱

辅图4：年轻和衰老灵长类动物组织中m⁶A修饰水平和m⁶A相关酶的表达水平

4. NPNT延缓骨骼肌衰老

为了进一步探究m⁶A修饰调控骨骼肌功能稳态的分子机制，研究人员对对照和METTL3缺失的肌管进行m⁶A表观转录组分析（Extended Data Fig. 5a–c），发现METTL3缺失肌管中m⁶A丰度显著降低（Fig. 5a）；其中由于METTL3缺失而丢失m⁶A修饰的mRNA主要富集在肌肉细胞分化、细胞连接组装、自噬、凋亡信号传导和肌肉组织发育相关途径中 （Extended Data Fig. 5d），表明METTL3介导的m⁶A修饰可能参与调控肌管萎缩。并且，在METTL3缺失肌管中，与肌肉发育和功能相关的基因表达显著降低（Extended Data Fig. 5e-f）。值得注意的是，RNA-seq结果显示METTL3缺失肌管中SASP相关基因表达上调（Extended Data Fig. 5g），这与RT-qPCR结果一致（Fig. 4k）。此外，研究人员还发现METTL3缺失肌管中与脂肪形成相关基因的表达水平显著上调（Extended Data Fig. 5h），这表明METTL3在维持肌管脂质代谢稳态中发挥重要功能。 

为了探究衰老骨骼肌中m⁶A水平改变的关键效应蛋白以及METTL3下游靶点，研究人员对衰老骨骼肌和METTL3缺失肌管中m⁶A下调的基因联合分析，确定了135个候选基因（Fig. 5b），研究人员推测这135个基因可能是METTL3的下游靶点，且与灵长类动物衰老过程中骨骼肌功能失调有关。随后研究人员对这135个基因进行功能通路富集分析，结果显示这135个基因高度富集在肌肉功能相关途径中，如肌动蛋白纤维相关途径、细胞生长调控、磷酸酶活性调控和细胞骨架蛋白定位。为了寻找METTL3下游关键靶点，研究人员将这135个m⁶A下调基因与肌管细胞中METTL3缺失后的差异表达基因联合分析，确定了NPNT作为METTL3下游靶点。已有研究报道NPNT蛋白在维持骨骼肌稳态方面发挥重要作用。随后，研究人员发现在衰老骨骼肌组织和METTL3缺失肌管中，NPNT的m⁶A水平以及基因表达水平均显著降低（Fig. 5d,e and Extended Data Fig. 5i,j），这表明NPNT可能是METTL3/m6A调控骨骼肌萎缩和肌管衰老中关键的效应蛋白。

为了探究NPNT在调控骨骼肌稳态中的作用，研究人员对肌管进行siRNA（短干扰RNA）处理以敲减NPNT基因（Fig. 5f-h）。与METTL3缺失肌管表型结果一致，NPNT的敲减也促使肌管直径和细胞核数量减小，且肌管中SA-β-gal活性增加，P16、Ⅰ型干扰素相关基因和SASP相关基因表达上调 （Fig. 5i-l），表明抑制NPNT表达可促进肌管衰老，这与METTL3缺失促进肌管衰老表型类似。同时，研究人员还发现NPNT敲减肌管中SASP相关基因和脂肪形成相关基因显著上调，这进一步表明METTL3-NPNT轴在调控肌管衰老中起着至关重要的作用。此外，在NPNT敲减肌管中肌肉结构和功能相关基因（如参与调控肌肉收缩和肌肉分化相关基因）显著下调 （Extended Data Fig. 6d,e），这表明NPNT在维持骨骼肌稳态中起着关键作用。值得注意的是，在METTL3缺失肌管中下调表达的基因，有超过1/3的基因在NPNT敲减肌管中的表达同样显著下调（Extended Data Fig. 6f,g），这进一步证明NPNT是METTL3调控肌管衰老的关键下游靶点。 

为了探究过表达NPNT是否能延缓由METTL3缺失引起的肌管衰老，研究人员构建了Flag标记的NPNT慢病毒（Flag-NPNT），并转染METTL3缺失肌管以过表达NPNT，以表达Flag标记的荧光素酶（Flag-luc）作为对照 （Extended Data Fig. 6h）。结果发现与对照组相比，过表达NPNT显著下调了P16和SASP相关基因表达，以及SA-β-gal活性 （Extended Data Fig. 6h-j），表明过表达NPNT可缓解METTL3缺陷肌管的衰老表型。总之，这些结果表明NPNT是METTL3/m⁶A调控骨骼肌衰老的下游靶点。

图5：NPNT是METTL3调控骨骼肌衰老的关键下游效应因子m⁶A相关酶的表达水平

辅图5：对照组和METTL3缺失肌管中的m⁶A修饰

辅图6：NPNT是METTL3调控骨骼肌衰老的关键下游效应因子

5.  METTL3以m⁶A依赖方式延缓肌管衰老

已有研究表明METTL3可以不依赖于m⁶A的方式调控基因表达。因此，为了探究METTL3调控NPNT表达以及肌管衰老是否依赖于m⁶A途径，研究人员首先用STM2457（STM2457是一种具有高效特异性和生物可利用性的METTL3酶活性抑制剂，且已有研究证明STM2457对其他RNA甲基转移酶活性无非特异性作用）处理野生型肌管，发现抑制METTL3活性后，肌管总m⁶A水平下降，NPNT基因表达显著下调（Extended Data Fig. 7a,b），且肌管直径显著减小，SA-β-gal活性显著增加（Extended Data Fig. 7c,d）。总之，这些结果表明抑制METTL3的RNA甲基转移酶活性可下调NPNT基因表达，并促进肌管衰老和萎缩。

随后，研究人员构建了METTL3突变体（METTL3-mut，氨基酸395-398位点的DPPW突变为APPA，该突变体抑制了METTL3的甲基转移酶活性但不影响METTL3蛋白表达），并在其载体上带上Flag标签。首先，研究人员在长期培养的野生型肌管中发现METTL3和NPNT表达水平显著下调，且SA-β-gal活性显著升高（Extended Data Fig. 7e,f）。随后，研究人员将Flag-luc、Flag-METTL3-wt和Flag-METTL3-mut转染进野生型肌管中，发现与Flag-luc肌管相比，过表达METTL3（Flag-METTL3-wt）显著促进了总m⁶A水平和NPNT表达水平，而突变抑制METTL3酶活性（Flag-METTL3-mut）消除了这种促进作用（Fig. 6a-c）。表型分析结果显示，过表达METTL3显著增加了肌管直径，并抑制了肌管衰老，而过表达METTL3-mut并没有引起这一现象（Fig. 6d-f）。总之，这些结果表明METTL3以m⁶A依赖的方式促进NPNT表达并维持肌管稳态。

为了探究m⁶A修饰调控NPNT表达的分子机制，研究人员首先分析了NPNT的选择性剪接水平，发现对照肌管和METTL3缺失肌管以及年轻和衰老骨骼肌组织中NPNT的选择性剪接变化并无明显差异（Extended Data Fig. 8a–c）。考虑到在衰老过程中，NPNT mRNA水平随着m⁶A水平的下调而下降，研究人员推测METTL3/m⁶A可能通过影响NPNT mRNA的稳定性来调节NPNT的表达。因此接下来，研究人员利用放线菌素D（一种转录抑制剂）处理对照肌管和METTL3缺失肌管，并在不同时间点检测NPNT mRNA水平，结果显示METTL3缺失显著降低了NPNT mRNA的稳定性（Extended Data Fig. 8d），表明m⁶A可能通过促进NPNT mRNA稳定性，从而上调NPNT的表达。随后，研究人员进一步探究m⁶A调控NPNT mRNA稳定性的分子机制。已有许多研究表明IGF2BPs是m⁶A阅读蛋白，通过识别结合具有m⁶A修饰的mRNA来促进mRNA的稳定性。研究人员通过分析先前研究发表的数据集（Huang H, et al. Nat Cell Biol. 2018），研究人员推测NPNT可能是IGF2BP1而非IGF2BP2和IGF2BP3的下游靶点。此外，RIP-qPCR结果表明在对照肌管中IGF2BP1明显与NPNT mRNA相互作用，而METTL3缺失抑制了IGF2BP1与NPNT mRNA的结合（Extended Data Fig. 8e），这进一步证明IGF2BP1可识别结合肌管中NPNT mRNA。利用siRNA敲减IGF2BP1后肌管中NPNT mRNA稳定性显著下降（Extended Data Fig. 8f,g），这表明IGF2BP1可促进肌管中NPNT mRNA稳定性。总之，这些结果表明IGF2BP1可识别METTL3介导的m⁶A修饰，促进NPNT mRNA稳定性，这一结果揭示了METTL3-m⁶A-NPNT轴在调控衰老骨骼肌功能稳态中的潜在转录调控机制。

总结   

已有许多研究充分证明m⁶A RNA修饰在多种生物途径中起着重要作用，但在衰老过程中其在组织水平上所发挥的功能及其分子机制还不清楚。为了填补这一方面的空白，研究人员分析比较了年轻食蟹猴和衰老食蟹猴肝脏、心脏和骨骼肌组织的m⁶A表观转录组，并揭示了m⁶A修饰与基因表达之间的密切联系，证明了衰老稳定的m⁶A mRNA通常与维持组织基本功能有关，而衰老获得或丢失的m⁶A mRNA则与组织特异功能（如组织特异性、年龄特异性）和较大的基因表达差异相关。重要的是，研究人员发现在衰老过程中，灵长类动物的骨骼肌中m⁶A缺失和METTL3表达下调水平最为明显，进一步研究发现METTL3以m⁶A甲基化转移酶活性依赖的方式调控肌管萎缩和衰老过程，并确定了NPNT是METTL3维持骨骼肌稳态的关键下游效应蛋白，在METTL3缺失的肌管中过表达NPNT可延缓肌管的衰老。最后，研究人员发现m⁶A阅读蛋白IGF2BP1可以结合并稳定NPNT mRNA。总之，本项研究首次在灵长类动物生理衰老期间的不同组织中进行了m⁶A表观转录组分析，并揭示了METTL3-m⁶A-NPNT轴的下调是衰老相关骨骼肌稳态失衡的驱动因素。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s43587-023-00393-2

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