1. BAT来源的Nrg4缺失加重炎症、内皮损伤和动脉粥样硬化，过表达Nrg4可缓解以上症状；

2. BAT移植可减轻Nrg4缺失导致的炎症、内皮损伤和动脉粥样硬化；

3. BAT来源的Nrg4抑制了白细胞归巢和ox-LDL诱导的MAECs损伤以及巨噬细胞聚集和炎症；

4. Nrg4通过ErBb4-NF-κB信号通路在动脉粥样硬化进展中发挥积极作用。

研究结果

1.动脉粥样硬化患者和小鼠中，Nrg4表达降低，炎症增加

       先前的研究发现，血浆Nrg4浓度与人类冠状动脉疾病的风险呈负相关。在本研究中，研究人员发现颈动脉粥样硬化患者的血浆Nrg4低于健康对照组（辅表1）。此外，与正常饮食(NCD)喂养的野生型(WT)小鼠相比，西方饮食(WD)喂养的ApoE敲除(AKO)小鼠(WD喂养12周)血浆中Nrg4水平和BAT中Nrg4的mRNA表达均降低(辅表2和辅图1e)。之前的研究还显示，动脉粥样硬化患者内皮功能受损(辅表1)。值得注意的是，单因素分析显示，在动脉粥样硬化患者(辅图1a)和小鼠(辅图1c)中，Nrg4与内皮依赖性动脉舒张之间存在相关性。以上结果提示Nrg4可能与内皮功能障碍和动脉粥样硬化有关。

        已知炎症是触发和加剧动脉粥样硬化进展的关键风险因素，因此研究人员检测了动脉粥样硬化患者和小鼠的炎症和粘连反应。结果显示，动脉粥样硬化患者和小鼠血浆中炎性细胞因子水平升高，包括IL-6、IL-1β和TNF-α，以及VCAM-1、ICAM-1和E-selectin(辅表1和2)。在动脉粥样硬化小鼠中，小鼠主动脉内皮细胞(MAECs)的炎症因子和粘附分子的表达显著增强(辅图1f)。此外，与之前的研究一致，动脉粥样硬化患者和小鼠的体重增加，血脂情况恶化(辅表1和2)。

NRG4

神经调节蛋白4（NRG4），是人类神经调节蛋白家族的一员，也是在一种脂肪组织富集的内分泌因子。NRG4通过酪氨酸磷酸化启动细胞间信号传导。此外，NRG4是ERBB4酪氨酸激酶受体的低亲和力配体，不与ERBB1、ERBB2和ERBB3受体结合。NRG4与ERBB4受体结合后，会同时募集ERBB1和ERBB2辅助受体，导致配体刺激的酪氨酸磷酸化和ERBB受体的激活，ERBB受体激活后通过Akt、MAPK以及其他多种通路来调节细胞增殖、迁移、分化、凋亡以及细胞移动。

已有研究表明，NRG4作用于肝脏来保证小鼠的正常代谢，它通过阻断细胞死亡负调节因子c-FLIPL的泛素化和蛋白酶体降解，以细胞自主方式减轻肝细胞死亡，同时，Nrg4激活肝脏脂肪酸氧化和生酮作用，促进了肥胖期间有益的脂质代谢，减轻了肝脏纤维化和炎症，从而能减轻应激诱导的肝损伤和饮食诱导的非酒精性脂肪肝，也有研究表明NRG4在巨噬细胞的促炎过程中诱导其受体ErbB4在促炎性巨噬细胞上高表达，从而诱导活化的促炎性巨噬细胞凋亡，调控肠道炎症中巨噬细胞的存活和功能。此外NRG4可在NASH相关的肝癌中作为激素检查点，抑制肝内TAM样巨噬细胞和CD8+ T细胞的衰竭，从而抑制易发肿瘤的肝脏免疫微环境，发挥抑癌作用。在本研究中，研究人员发现，BAT特异性Nrg4缺失可加速血管炎症、内皮功能障碍和动脉粥样硬化，并最终证实了Nrg4通过ErBb4-NF-κB信号通路在动脉粥样硬化进展中发挥积极作用，可作为动脉粥样硬化治疗的潜在靶点。

参考文献

[1] Aleix Gavaldà-Navarro,et al.Rev Endocr Metab Disord. 2022 Feb;23(1):31-41.

[2] Jiandie D Lin,et al.Cell Metab. 2022 Sep 6;34(9):1359-1376.e7.

辅图1：Nrg4缺失导致内皮功能障碍增加和代谢受损

辅表1：对照和颈动脉粥样硬化受试者的临床生化特征

辅表2：ApoE-WT和ApoE-KO小鼠晚期的代谢和炎症特征

2.Nrg4缺乏加重小鼠内皮损伤和炎症

接下来研究人员进一步探究了Nrg4缺乏是否会导致小鼠内皮损伤和炎症。首先，研究人员确认Nrg4-KO小鼠血浆、BAT、血管内皮和肝脏中Nrg4的缺失(辅图1g-i)，其次，在喂食WD或NCD 12周的KO和WT小鼠中检测内皮损伤情况(辅图1j)。结果表明，与WD-WT和NCD-WT小鼠相比，Nrg4-KO损伤了血管内皮依赖性舒张(KO-WD小鼠减少35%，KO-NCD小鼠减少28%)(图1c)，内皮细胞凋亡增加(图1a,b)，完整的内皮细胞减少(图1e)，这些影响在WD喂养的小鼠中更严重。此外，KO小鼠血浆和MAECs中IL-1β、IL-6、TNF-α等炎症细胞因子以及VCAM-1、ICAM-1、E-selectin等粘附分子水平均显著升高(辅表2，图1f)。值得注意的是，与WD-WT小鼠和NCD-WT小鼠相比，KO小鼠糖耐量和胰岛素敏感性受损，血脂情况恶化，体重增加。上述糖脂代谢表型在WD喂养小鼠中更显著(辅表2和辅图1k-m)。此外，KO和WT小鼠每周的食物摄入量没有显著差异，但KO小鼠的eWAT重量比WT小鼠更重，且WD喂养的KO能量消耗较少(辅图2a-c)，这些变化可能是导致KO小鼠体重增加的原因。KO组和WT组的血压、糖化血红蛋白或总粪便质量没有差异(辅表2)。综上所述，这些结果表明Nrg4缺乏与内皮损伤和炎症有关。

图1：Nrg4缺失与小鼠内皮损伤和炎症相关

辅图2：Nrg4减轻MAECs的炎症和粘连反应，改善后的小鼠能量代谢

3.Nrg4缺乏加速apoe敲除小鼠的动脉粥样硬化

上述实验已经证实了Nrg4缺乏会加重小鼠内皮损伤和炎症，为了探究其是否会加速动脉粥样硬化的形成，研究人员选择6周龄的AKO或apoe和nrg4双敲除(DKO)小鼠喂养WD 12周。结果显示，在DKO小鼠中，Nrg4缺失损害了血管内皮依赖性舒张作用(图2a)，并增加了动脉粥样硬化病变面积(3.1倍)或主动脉根横切面(2.6倍)(图2c-f)。此外，与AKO小鼠相比，DKO小鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)或胶原蛋白减少，巨噬细胞和T淋巴细胞浸润面积增加(图2g,h)，坏死核心区占病变面积的比例增加，胶原纤维厚度减少(图2i,j)，主动脉组织MMP2和MMP9的表达增加(图2k,l)，MAECs中炎症因子和粘附分子的表达也有所增加(图2m)。总之，Nrg4缺失使AKO小鼠更容易发生动脉粥样硬化和动脉粥样硬化斑块不稳定。

图2：在AKO小鼠中Nrg4缺乏与动脉粥样硬化斑块形成有关

4.BAT来源的Nrg4缺失加速内皮损伤和动脉粥样硬化

紧接着为了探究BAT特异性Nrg4缺失对内皮细胞的影响，研究人员使用UPC1-cre小鼠与Nrg4-loxp小鼠构建了BAT-Nrg4条件敲除(BKO)小鼠模型(辅图2d,e)，结果显示，BAT特异性Nrg4缺失小鼠表现出内皮功能或完整性受损和MAEC凋亡增加(图3a-d)。

为了进一步探究BAT特异性Nrg4缺失对动脉粥样硬化的影响，研究人员将BKO和AKO小鼠杂交生成BKO/AKO (apoe^−/−和BAT-Nrg4^−/−-DKO)小鼠。结果发现，与WT小鼠相比，BKO/AKO小鼠MAECs中炎症因子和粘附分子的表达更高(辅图2f)，主动脉正面和横截面的动脉粥样硬化面积更大(图3e-h)，斑块不稳定性增加(图3i-n)。总的来说，BAT来源的Nrg4缺乏加重了内皮损伤和动脉粥样硬化。

图3：BAT来源的Nrg4缺失加速内皮损伤和动脉粥样硬化

5.BAT特异性过表达Nrg4可减轻KO小鼠内皮损伤和炎症

已经验证了BAT来源的Nrg4缺乏会加速内皮损伤和动脉粥样硬化，接下来研究人员探究了BAT特异性Nrg4过表达对KO小鼠内皮损伤和炎症的影响。研究人员将AAV-Nrg4过表达至BAT，首先使用Nrg4标记和示踪法确认了Nrg4在小鼠血管内皮上表达 (辅图2g)，当BAT中过表达AAV-Nrg4后，促进小鼠主动脉血管舒张，说明其可在KO小鼠血管内皮上发挥作用 (辅图2i和4a)。接下来，研究人员将AAV-Nrg4或AAV-Zsgreen注射到6周龄雄性小鼠的肩胛间的BAT部位。干预8周后，生物发光成像显示AAV-Zsgreen在肩胛间BAT中表达（辅图2h）。另外，单次注射AAV-Nrg4 7天后，KO小鼠血浆中可检测到循环Nrg4，并持续了12周（辅图2i）。在注射18周时，BAT中存在高丰度的Nrg4蛋白表达，但在eWAT、iWAT或肝脏中不存在(辅图3a)。最后，科研人员检测过表达Nrg4对小鼠内皮功能、炎症和代谢的影响。将6周龄的KO和WT小鼠分为3组（WT、KO-AAV- Nrg4, KO-AAV-Zsgreen），WD饲喂12周（辅图2j）。实验结果显示，与KO-AAV-Zsgreen相比BAT来源的Nrg4改善了内皮功能障碍，减少了MAECs凋亡，增加了完整的内皮细胞数目，减少了MAECs中炎症因子(TNF-α，IL-1β和IL-6)或粘附分子(VCAM-1,ICAM-1和E-selectin)的表达(图4a-d,f)，改善了糖耐量、胰岛素敏感性(辅图3b,c)和血脂异常(图4g)，减缓了体重增加(图4e)，增加了能量消耗。这些数据表明，恢复BAT来源的Nrg4可改善内皮损伤，抑制内皮炎症反应。

图4：Nrg4过表达减轻了KO小鼠的内皮损伤和炎症，并改善了代谢

辅图3：BAT来源的Nrg4改善了小鼠的代谢，减轻了内皮功能障碍和炎症或粘连反应

6.BAT特异性过表达Nrg4缓解AKO和DKO小鼠动脉粥样硬化

接下来研究人员使用AKO和DKO小鼠来验证恢复BAT来源的Nrg4是否具有抗晚期动脉粥样硬化的作用(辅图3g)。实验动物分为：AKO+AAV-Nrg4 (AKO-AAV(Nrg4))、AKO+AAV-Zsgreen (AKO-AAV (Zsgreen))、DKO+AAV-Nrg4 (DKO- AAV (Nrg4))和DKO+AAV-Zsgreen (DKO-AAV(Zsgreen))组。结果显示，与AKO-AAV (Zsgreen)小鼠相比，DKO-AAV(Zsgreen)小鼠的动脉粥样硬化病变面积显著增加(正面2.8倍，横截面2.6倍)，表明Nrg4缺乏显著促进了动脉粥样硬化病变。与预期一致，AAV-Nrg4治疗增加了血浆Nrg4浓度(辅图3e)，缓解了内皮功能障碍，减少了动脉粥样硬化病变面积(图5a-d和辅图3f)，并通过改善细胞成分增强了斑块稳定性，增加胶原纤维厚度，降低了AAV-Zsgreen动物中动脉粥样硬化斑块中坏死核心面积与病变大小的比例，降低主动脉中MMP2或MMP9的表达(图5e-j)，抑制了MAECs中炎症因子(TNF-α，IL-1β和IL-6)或粘附分子(VCAM-1,ICAM-1和E-selectin)的表达(辅图3i)。以上数据表明，BAT来源的Nrg4缓解动脉粥样硬化并改善斑块成分，以保护斑块稳定的表型。

图5：Nrg4过表达可减轻小鼠动脉粥样硬化

7.BAT移植可减轻KO小鼠的内皮损伤和炎症

为了进一步验证BAT特异性Nrg4对小鼠内皮损伤和炎症的积极影响，研究人员对KO小鼠进行了BAT移植(BATT)。首先，研究人员探索了适合KO受体移植BAT的质量。研究人员将来自12周龄WT供体的0.1或0.4 g BAT分别移植到12周龄的KO小鼠受体的内脏脂肪中，通过在KO受体中进行的初步研究来探索移植的BAT的有效质量。值得注意的是，术后4周Nrg4开始在循环中显著表达，并持续稳定表达12周(辅图3j)。另外，在术后6周，移植0.4 g BAT组的循环Nrg4浓度与WT小鼠更接近，所以在接下来的移植实验中研究人员选择了0.4 g作为BAT的移植质量并按照辅图3h所示的设计实验流程将12周龄小鼠分为3组：1）WT小鼠进行BAT移植假手术；2.）KO小鼠接受WT小鼠BAT移植组；3.）KO小鼠接受KO小鼠 BAT移植组，WD饲喂12周。结果表明，来自WT供体的BAT移植可改善KO受体的内皮功能障碍，减少内皮细胞凋亡，改善内皮完整性，抑制MAECs中的炎症因子(TNF-α，IL-1β和IL-6)或粘附分子(VCAM-1,ICAM-1和E-selectin)表达(辅图4a-e)。一致的是，与接受KO BAT移植的小鼠相比，接受WT BAT移植的小鼠，在葡萄糖清除、胰岛素敏感性和血脂方面有显著改善，体重增加量减少，能量消耗增加(辅图4f-g和3l-p)。这些数据证实了BAT特异性Nrg4补充可以改善内皮损伤，抑制内皮炎症或粘附反应。

辅图4：来自WT供体的BAT移植减轻了小鼠内皮损伤、炎症和动脉粥样硬化，并改善了代谢

8.性别依赖性高脂血症与宿主的防御反应有关

为了进一步证明BAT来源的Nrg4对动脉粥样硬化的保护作用，研究人员对AKO和DKO小鼠分别进行WT/KO BAT移植，将12周龄的小鼠分为4组：1）AKO小鼠接受WT小鼠BAT移植;2)AKO接受KO小鼠BAT移植；3)DKO小鼠接受WT小鼠BAT移植;4)DKO小鼠接受KO小鼠BAT移植,之后WD饲喂12周）(辅图3k)。结果与过表达AAV-Nrg4一致，相比与移植KO BAT的AKO或DKO小鼠，移植WT BAT缓解了动脉粥样硬化(辅图4h-k)，并改善了斑块稳定性(辅图4l-q)。移植WT供体BAT的DKO小鼠动脉粥样硬化的改善更为明显。这些结果均支持BAT来源的Nrg4可以缓解动脉粥样硬化的进展并提高斑块的稳定性。

9.BAT中原位过表达Nrg4阻断了DKO小鼠主动脉中白细胞归巢

已知炎症诱导主动脉斑块处白细胞归巢和巨噬细胞聚集。值得注意的是，上述动物实验表明，BAT来源的Nrg4减少了斑块内CD68阳性巨噬细胞的数量(图2g,3i,4e,)。因此，研究人员接下来检测了WD喂养12周的DKO小鼠通过原位过表达Nrg4后白细胞招募的情况。结果显示，首先，与AAV-Zsgreen小鼠相比，在AAV-Nrg4治疗组内皮来源的趋化因子(ccl2,cxcl1,ccl3,ccl4,ccl5,ccl7,cxcl9和cxcl10)和有助于白细胞归巢的巨噬细胞标记物(F4/80和CD68)的mRNA水平显著降低(图6a,b)。其次，研究人员从绿色荧光蛋白(GFP)表达小鼠中利用巯基乙酸方法刺激腹膜提取巨噬细胞，并通过静脉注射到DKO-AAV (Nrg4)和DKO-AAV (Zsgreen)小鼠体内，然后测定主动脉根部GFP阳性细胞水平，以评估注射48小时后白细胞归巢情况。结果表明，与DKO-AAV (Zsgreen)小鼠相比，DKO-AAV (Nrg4)小鼠斑块内GFP阳性细胞减少71%（小编注：AKO (Apoe^-/-)小鼠是自发的动脉粥样硬化模型小鼠，喂养正常饲料的AKO小鼠早期泡沫细胞病变可在10周内发生，15周后发展成动脉粥样硬化病变，20周后演变成晚期纤维病变。高脂肪/高胆固醇饮食可加速这一致病过程，包括促进胆固醇结晶、坏死核心和钙化的形成。）(图6c,d)。另外，已知白细胞粘附分子ICAM-1和VCAM-1是介导白细胞归巢应对内皮炎症的关键。与这一结果一致的是，与DKO-AAV (Zsgreen)小鼠相比，主动脉弓（小编注：主动脉弓为主动脉上部弓形弯曲的部分。从弓的凸侧发出3条较大的动脉，由右向左依次分为无名动脉、左颈总动脉和左锁骨下动脉。）免疫荧光显示DKO-AAV (Nrg4)小鼠的ICAM-1和VCAM-1表达明显降低(图6e,f)。总的来说，这些结果表明，BAT来源的Nrg4抑制了动脉粥样硬化斑块内的白细胞归巢和巨噬细胞聚集。

图6：BAT的Nrg4原位过表达可减少DKO小鼠主动脉斑块内的白细胞归巢

10.BAT来源的Nrg4在共培养体系中减轻ox-LDL诱导的MAEC损伤

       为了在体外模拟BAT与动脉之间通过Nrg4的相互作用，研究人员进行了共培养实验。MTT试验表明，100μg ml⁻¹的氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)作用12 h时，MAECs的存活率显著下降(辅图5f)，因此研究人员选择100μg ml⁻¹的ox-LDL作用12 h作为后续实验的最佳干预条件。随后，将KO和WT小鼠BAT来源的棕色脂肪细胞(BAs)与WT小鼠的MAECs在ox-LDL刺激条件下共培养。结果表明，与共培养的KO小鼠来源的BAs相比，WT小鼠来源的BAs可以减轻MAEC损伤，其具体表现为抑制MAEC凋亡，降低Bax/Bcl-2比值和减弱caspase 3的表达，减轻炎症因子(TNF-α，IL-1β和IL-6)或粘附分子(VCAM-1,ICAM-1和E-selectin)表达(辅图5a-e)。因此，上述共培养实验直接证明了BAT来源的Nrg4对血管内皮损伤具有保护作用，并且Nrg4是BAT与内皮之间的相互作用因子。

辅图5：棕色脂肪细胞(BA)或rNrg4可减少MAECs的凋亡、粘附和炎症反应

11.Nrg4可减轻ox-LDL诱导的MAECs凋亡和炎症反应

由于Nrg4受体ErbB4存在于MAECs中，研究人员假设Nrg4对内皮有直接影响。根据MTT实验，研究人员选择了小鼠重组蛋白Nrg4 (rNrg4) 100 ng ml⁻¹（小编注：由辅表1知，人体内Nrg4生理浓度为3.91±1.15ng ml⁻¹），持续作用48 h作为后续实验的最佳干预条件(辅图5g)，并用ox-LDL处理MAECs，以模拟Nrg4不存在或存在时的动脉粥样硬化情况。结果显示，rNrg4治疗可减轻MAEC凋亡，降低Bax/Bcl-2比值和减弱caspase 3的表达，降低内皮通透性，减轻炎症因子(TNF-α，IL-1β和IL-6)或粘附分子(VCAM-1,ICAM-1和E-selectin)表达(辅图5h-l)。这些数据进一步支持了Nrg4对MAECs具有直接抗炎保护作用的假设。

12.Nrg4减轻ox-LDL诱导的巨噬细胞炎症

已有研究表明，巨噬细胞是主动脉斑块的关键细胞成分。值得注意的是，研究人员目前的动物实验表明Nrg4抑制主动脉斑块中的白细胞归巢和巨噬细胞聚集。因此，研究人员利用RAW264.7细胞株进一步探索了Nrg4是否对巨噬细胞有直接影响。结果显示，Nrg4抑制了RAW264.7细胞中ox-LDL诱导的炎症反应(TNF-α，IL-1β和IL-6)(辅图6e)，还抑制了RAW264.7细胞的迁移(辅图6a,b)。综上，Nrg4对主动脉斑块的积极影响与抑制巨噬细胞迁移和炎症有关。

辅图6：Nrg4在体内可降低巨噬细胞的炎症和迁移，并通过ErbB4受体抑制内皮细胞NF-κB信号

13.ErBb4-NF-κB信号通路是Nrg4在动脉粥样硬化中发挥积极作用的重要途径

为了探究Nrg4对动脉粥样硬化保护作用的机制，研究人员对6周龄KO小鼠BAT分别过表达AAV-Nrg4或AAV-Zsgreen后WD饲喂12周后，通过流式分选内皮细胞进行了全基因组微阵列分析，以探索内皮中可能的通路。结果发现rNrg4在内皮细胞中抑制NF-κB通路相关基因的表达(图7a,b)，这与之前的发现一致，即动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病，NF-κB激活有助于炎症的发生。接下来，研究人员检测了MAECs中NF-κB的信号。结果如图7c-f所示，与WT对照相比，KO小鼠MAECs中细胞核磷酸化-p65(P-p65)和细胞质磷酸化I-κBα (P-IκBα)水平升高，而过表达aav-Nrg4后逆转了以上变化。此外，rNrg4治疗显著抑制了ox-LDL诱导的p65核易位、P-IκBα和P-p65在体外MAECs的表达(图7g,h,i和辅图6c,d)。这些结果表明，NF-κB信号通路参与了Nrg4对内皮细胞炎症的有益作用。

已知ErbB4受体酪氨酸激酶介导Nrg4相关的生物学功能。因此，研究人员假设Nrg4通过ErbB4受体酪氨酸激酶调节内皮功能。为了在体内验证这一假设，研究人员构建了内皮特异性 ErbB4 KO (CKO)小鼠模型(ErbB4^loxP/loxP小鼠与Cdh5Cre小鼠杂交，生成内皮条件性ErbB4 KO小鼠，Cdh5Cre;ErbB4^f/f;辅图6f)。结果显示，与WT对照组相比，来自Cdh5Cre;ErbB4^f/f的MAECs中ErbB4表达显著降低(辅图6h,i)，证实了内皮特异性ErbB4的缺失。接下来，研究人员将Cdh5Cre;ErbB4^f/f小鼠与KO小鼠进一步杂交，生成Cdh5Cre;ErbB4^f/f/KO (ErbB4 CKO/KO)小鼠(辅图7a)，然后将6周龄雄性小鼠按以下方式分组：1） WT小鼠NCD饲喂12周；2）WT小鼠WD饲喂12周；3）KO小鼠过表达AAV-Zsgreen后WD饲喂12周；4）KO小鼠过表达AAV- Nrg4后WD饲喂12周；5）ErbB4 CKO/KO小鼠过表达AAV-Zsgreen后WD饲喂12周；4. ErbB4 CKO/KO小鼠过表达AAV- Nrg4后WD饲喂12周 (辅图6g)。结果发现，与KO-AAV(Zsgreen)组相比，在ErbB4受体存在的条件下，KO小鼠中Nrg4的恢复抑制了NF-κB信号通路，从而改善了内皮损伤，具体表现为细胞质P-IκBα和核P-p65的表达降低(辅图6j,k)，炎症因子(TNF-α，IL-1β和IL-6)的mRNA表达降低，内皮功能和完整性改善，内皮细胞凋亡减少。而在ErbB4受体缺失的情况下，在CKO小鼠中恢复Nrg4表达也无法引起相应变化(辅图6I,m和辅图7b-e)。以上这些数据说明了Nrg4在体内通过ErbB4受体调控NF-κB信号和内皮表型。此外，研究人员还探究了内皮细胞ErbB4是否参与了动脉粥样硬化的进展。为此研究人员构建了Cdh5Cre;ErbB4^f/f/ApoeE DKO (CKO/AKO)小鼠（内皮细胞ErbB4敲除和Nrg4及APOE敲除小鼠），并对6周龄小鼠进行如下实验分组：1）CKO/AKO小鼠过表达AAV-Zsgreen后WD饲喂12周；2）CKO/AKO小鼠过表达AAV-Nrg4后WD饲喂12周；3）AKO小鼠过表达AAV-Zsgreen后WD饲喂12周；4）AKO小鼠过表达AAV-Nrg4后WD饲喂12周（辅图7f)。与预期一致，Nrg4的补充减少了AKO小鼠的动脉粥样硬化病变面积，但在CKO/AKO小鼠中并无显著变化(辅图7g-j)，这证实了ErbB4在Nrg4抗动脉粥样硬化作用中的关键作用。基于上述数据可以得出结论，Nrg4在体内通过ErbB4受体调节NF-κB信号和内皮表型以及动脉粥样硬化。

接下来研究人员探究了连接ErbB4受体与NF-κB信号的中间分子。已有越来越多的证据表明，蛋白激酶B (Akt)、细胞外信号调节激酶(ERK)、AMP活化蛋白激酶(AMPK)和IκB激酶(IKK)信号可能是ErbB4信号转导到NF-κB信号的传导介质。因此，研究人员在体内研究了这些信号分子在内皮细胞中的表达。结果显示，当ErbB4受体存在时，Nrg4可刺激P-Akt表达，进而抑制NF-κB信号通路(辅图7k-n)，伴随着内皮功能和完整性改善，内皮细胞凋亡减少，而在ErbB4受体不存在时，这些变化也不存在(辅图7c-e)；然而，其他分子包括P-ERK、P-AMPK和P-IKK在不同干预措施条件下（KO小鼠分别过表达AAV-Zsgreen和AAV-Nrg4；CKO/KO小鼠分别过表达AAV-Zsgreen和AAV-Nrg4则没有显著差异(辅图7k-n)。这些结果表明Akt位于ErbB4受体的下游，介导Nrg4对内皮的作用。

为了进一步证实ErbB4-Akt-NF-κB信号通路参与了Nrg4对血管内皮细胞的有益作用，研究人员通过转染小干扰RNA (si-ErbB4)(和转染si-control作为对照)，沉默了ErbB4 (NM_010154)在MAECs中的表达(辅图7o,p)，并使用ox-LDL和Nrg4处理MAECs时，分别加入Si-ErbB4/Si-control/Sc79处理(辅图8a)。结果表明，ox-LDL抑制了MAECs中的P-Akt并刺激了NF-κB信号通路(辅图8a,b)，从而增加炎症因子(TNF-α，IL-1β和IL-6)或粘附分子(VCAM-1,ICAM-1和E-selectin)表达，促进FITC-葡聚糖的迁移，以及在ox-LDL诱导的MAECs中单核细胞粘附实验中细胞表面粘附增多，而Nrg4补充后这些反应减弱(辅图8c-e)。此外，当ErbB4受体沉默时，Nrg4对炎症或粘附反应的影响消失(辅图8c)，这表明ErbB4受体对内皮上Nrg4的调节至关重要。为了进一步检测Akt是否参与MAECs中ErbB4-NF-κB信号通路，研究人员使用SC79 (Akt激活剂，10 μM，处理6小时)进行了功能获得实验。结果表明，在ErbB4沉默诱导的Akt活性降低的情况下，Akt激活剂可以抑制被激活的NF-κB信号和炎症反应，减少内皮细胞凋亡(辅图8a-c,f,g)，从而确认了Akt通过NF-κB信号通路参与Nrg4对内皮的调节。

接下来为了进一步证实Nrg4对人类内皮功能的有益作用，研究人员对三名结直肠癌患者的肠系膜动脉环进行了离体实验。在从分离组织中制备动脉环后，研究人员在TOBS-1500M组织器官浴中对动脉环进行了6种不同干预培养（小编注：离体组织器官浴槽系统TOBS-1500M是一种设计新颖、结构简洁、易于操作并易于清洗和维护的离体组织张力测定系统，可用于各种离体组织的动力研究，包括：离体肌肉、动脉血管环和血管条、子宫组织、输精管、回肠、结肠、离体心房、心室及隔膜等）：1)NC组(Krebs-Ringer缓冲液处理48 h)；2) ox-LDL组(Krebs-Ringer缓冲液处理48 h+100μg ml^-1 ox-LDL处理12 h);3) PDTC组(Krebs-Ringer缓冲液处理48 h+100μmol l⁻¹ PDTC(一种NF-κB抑制剂)处理48 h+100μmol ml⁻¹ ox-LDL处理12 h); 4)Nrg4组(Krebs-Ringer缓冲液处理48 h+100ng ml⁻¹ Nrg4 处理48 h+100μg ml⁻¹ ox-LDL处理12 h);5)MK2206组(Krebs-Ringer 缓冲液处理48 h+100 ng ml⁻¹ Nrg4处理48 h+1 μmol l⁻¹MK2206 (Akt抑制剂)处理48 h+100μg ml⁻¹ ox-LDL处理12 h);6)dacomitinib组(krebs-ringb缓冲液处理48 h+100ng ml⁻¹ Nrg4处理48 h+20 mmol l⁻¹dacomitinib(一种不可逆ErbB抑制剂)处理48 h+100μg ml⁻¹ ox-LDL处理12 h)。之后研究人员检测了动脉的内皮依赖性舒张功能。结果表明，Nrg4或PDTC治疗可改善ox-LDL诱导的人动脉环内皮功能障碍，而MK2206或dacomitinib处理减弱了Nrg4的有益作用(辅图8h)。结果进一步支持了Nrg4对内皮细胞的有益作用与ErbB4-Akt-NF-κB信号通路有关。

最后研究人员探究了Nrg4如何调节NF-κB的转录和结合活性。研究人员使用含有NF-κB结合元件的荧光素酶报告基因在siRNA-ErbB4(si-ErbB4)或si-control处理MAECs的同时使用了Ox-LDL及Nrg4干预细胞。结果表明，Ox-LDL处理可以促进NF-κB的转录，而Nrg4处理抑制了Ox-LDL诱导的NF-κB转录活性上调。使用si-ErbB4敲减ErbB4后，Nrg4对Ox-LDL诱导的NF-κB转录活性上调抑制被解除，表明Nrg4通过ErbB4受体调节NF-κB转录活性 (辅图8i)。同时，在si-control处理的MAECs中，Nrg4可以减弱ox-LDL诱导的NF-κB转录活性，但在si-AKT处理的MAECs中，这些变化减弱(辅图8j)，这表明ErbB4-Akt轴参与了Nrg4对NF-κB转录活性的调节。为了进一步支持这一结论，研究人员进行了p65染色质免疫沉淀(ChIP)试验。结果发现，在ErbB4存在的MAECs中加入Nrg4时，ox-LDL诱导的p65与VCAM-1、E-selectin和IκBα启动子结合的减少(辅图8k-m)。此外，Nrg4诱导的p65与VCAM-1、E-selectin和IκBα启动子结合，在si-AKT处理的MAECs中显著增加(辅图8n-p)。综上所述，这些数据表明Nrg4通过ErbB4-Akt轴抑制NF-κB的转录和结合活性。

图7：Nrg4在体内外均能抑制NF-κB信号

辅图7：ErbB4/Akt信号参与Nrg4对内皮细胞的保护作用

辅图8：Nrg4通过ErbB4/Akt/NF-κB信号抑制MAECs的炎症和粘附反应

图8： Nrg4通过ErbB4-Akt-NF-κB信号通路在动脉粥样硬化中发挥保护作用

总结

棕色脂肪组织(BAT)通过其能量消耗促进心血管健康，但BAT如何通过内分泌机制调节血管功能和动脉粥样硬化仍知之甚少。本研究表明，BAT来源的Nrg4可改善小鼠动脉粥样硬化。在雄性小鼠中，BAT特异性Nrg4缺失可加速血管炎症和粘附反应、内皮功能障碍、细胞凋亡和动脉粥样硬化。相应地，BAT特异性Nrg4恢复可减轻血管炎症和粘附反应，减弱白细胞归巢，改善内皮损伤和动脉粥样硬化。在内皮细胞中，Nrg4可降低氧化低密度脂蛋白诱导的凋亡、炎症和粘附反应。机制上，Akt-NF-κB信号通路参与了Nrg4对内皮功能的有益作用。研究结果表明Nrg4是BAT和动脉之间潜在的相互作用因子，可作为动脉粥样硬化的治疗靶点。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s42255-022-00671-0

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