敲黑板啦！

1. 年轻脂肪细胞抵抗胞浆mtRNA诱导的干扰素反应

2.抑制IRF7相关信号通路促进米色脂肪生物合成

3.维生素D抑制年轻脂肪细胞中IRF7的表达

4.出生后早期肥胖促进脂肪细胞中IRF7的表达

研究结果

线粒体DNA(mtDNA)是存在于线粒体基质中的一种环状的双链(ds)DNA分子。因为mtDNA中存在大量未甲基化的CpG基序，与细菌DNA结构相似，所以其大量外排会引发较强的免疫反应。

在炎症等病理情况下，线粒体膜通透性发生变化，使得mtDNA外排进入细胞质基质。一方面，这些外排的mtDNA能被溶酶体等结构中的TLR9(Toll-like receptors 9)检测识别，激活NF-κB信号通路，从而诱发炎症反应。另一方面，环状GMP-AMP合酶(cGAS)也能够直接检测到泄露到细胞质基质中的mtDNA，并与其结合形成二聚体，并促进ATP和GTP转变为2’3’环状GMP-AMP(cGAMP，一种第二信使)。cGAMP进而与内质网中的 IFN应答基因刺激因子(STING)结合，使其构象发生变化，磷酸化激活TANK结合激酶1 (TANK-binding kinase 1, TBK1)和干扰素调节因子3 (Interferon regulatory factor 3, IRF3)，刺激干扰素基因的转录，最终引发干扰素反应。

此外，由于mtDNA双向转录的特性，mtDNA极易转录生成具有双链结构 (mtdsRNA结构)的mtRNA，这与病毒和细菌的dsRNA结构类似。因此，mtDNA具有高免疫原性。正常情况下，线粒体解旋酶SUV3和多核苷酸磷酸化酶（polynucleotide phosphorylase，PNP酶）能够降解dsRNA，抑制dsRNA的积累。但是，当SUV3和PNP耗尽时，线粒体dsRNA在线粒体中大量积累，并在促凋亡孔蛋白Bax(Bcl2-associated X protein, Bcl2相关X蛋白)-Bak(Bcl-2 homologous antagonist/killer, Bcl-2同源拮抗剂)复合物的介导下逃逸到细胞质中，进而激活体内主要的病毒dsRNA受体如维甲酸诱导基因I(Retinoic acid-inducible gene I, RIG-I)和RIG-I样黑色素瘤分化相关蛋白5(Melanoma differentiation-associated protein 5, MDA5)，启动Ifnb基因的表达，最终引起由IFN-β介导的干扰素反应。

参考文献：

[1] Riley JS et al.EMBO Rep. 2020 Apr 3;21(4):e49799.

[2] Dhir .et al. Nature. 2018 Aug;560(7717):238-242.

目前，干扰素影响线粒体能量产生和热量的过程仍存在许多争议。有报道称线粒体dsRNA通过Bax-Bak孔从线粒体泄露并结合MDA5，MDA5则主要通过激活线粒体MAVS信号通路产生IFN-β。因此，为探究IFN-β（小编注：已知线粒体dsRNA通过Bax-Bak孔从线粒体泄露，然后结合MDA5，MDA5主要通过激活线粒体MAVS信号通路产生IFN-β，因此作者这里主要以IFN-β进行研究）对脂肪细胞线粒体的影响，研究人员培养了成年小鼠和非肥胖非糖尿病人（年龄范围为16-17岁）的皮下脂肪细胞，并用IFN-β处理（图S1A）。实验结果表明，IFN-β处理后的人和小鼠脂肪细胞会导致脂肪细胞线粒体损伤和线粒体自噬(图1D和图S1B)，线粒体质量减少（图1E），并降低线粒体酶环氧合酶I(Cyclooxygenase I, COX-I)和琥珀酸脱氢酶A(Succinate dehydrogenase A, SDH-A)的水平（图1F），增加前体脂肪细胞中的脂质积累（图1G）。此外，作者发现在肥胖的人类脂肪细胞中IFN-β强烈表达（图1H）。这些结果表明，IFN-β对线粒体的影响以及IFN-β在肥胖脂肪细胞中的强烈表达，与先前报道的脂肪细胞中干扰素和干扰素刺激基因(IFN-stimulated genes, ISGs)显著表达可能会促进肥胖发生的研究结果相一致。

已知胞质mtRNA通过胞质RNA感受器如RIG-I和MDA5启动Ifnb(Ifnb1)基因的表达。因此，研究人员使用胞质RNA感受器的合成配体，即聚合(脱氧腺苷-脱氧胸腺酸)酸(poly(deoxyadenylic-deoxythymidylic) acid, Poly(dA：dT)转染成年脂肪细胞进而上调Ifnb表达，使脂肪细胞中Ifnb水平与胞质mtRNA刺激后的Ifnb水平一致(图1I)。胞质Poly(dA：dT)被RNA聚合酶III识别后转录成dsRNA，进而刺激RIG-I和MDA5等胞质RNA感受器 (图S1C)。此外，胞质中的Poly(dA：dT)可模拟IFN-β，对小鼠和人类脂肪细胞线粒体产生相似的影响(图1J和图1K)。当使用IFN-β抗体处理小鼠和人类脂肪细胞后，胞质Poly(dA：dT)对小鼠和人类的脂肪细胞线粒体损伤程度减少，COX-I和SDH-A的水平也轻微上调。

研究人员发现转染胞质mtRNA（图1C）或胞质Poly(dA：dT)都不能诱导幼龄小鼠脂肪细胞中的Ifnb转录水平（图1L），且能够抵抗胞质Poly(dA：dT)诱导的线粒体损伤（图1M)。但在成年小鼠中转染胞质mtRNA或胞质Poly(dA：dT) 能够显著上调脂肪细胞Ifnb转录水平。作者认为，成年小鼠脂肪细胞中存在MDA5和RIG-I基因，且成年小鼠脂肪细胞能够正常转染Poly(dA：dT) ，因此以上原因并不能够解释这种差异（图S1C-F）。

当研究人员用Poly(dA：dT)转染人类脂肪细胞（分别来自婴儿（0-1岁）、儿童（2-11岁）和青少年（15-17岁））时，发现婴儿和儿童的脂肪细胞与幼龄小鼠的脂肪细胞相似，也能够抵抗胞质Poly(dA：dT)诱导的线粒体损伤（图1N），并且婴儿的脂肪细胞与幼龄小鼠的脂肪细胞相似，COX-I和SDH-A水平增加（图1M和图1N）。然而，在青少年的脂肪细胞中，转染胞质Poly(dA：dT)反而降低了COX-I和SDH-A水平（图1N)，这些结果表明Poly(dA：dT)对人类青少年脂肪细胞的影响与成年小鼠脂肪细胞中的类似。（图1M)。

图1.mtRNA不会引发年轻脂肪细胞的炎症反应

图S1.脂肪细胞识别胞质mtRNA

IRF3和IRF7形成同源二聚体或异源二聚体后激活Ifnb的转录，进而触发IFN反应。因此，脂肪细胞IRF3或IRF7的缺失同样可以保护线粒体免受胞质Poly(dA：dT)的损伤(图2A)。

为了证实这一观点，研究人员检测了幼龄和成年小鼠脂肪细胞中Irf3和Irf7的转录水平。结果发现Irf3 在年轻和成年脂肪细胞中的转录水平相似，但Irf7在成年脂肪细胞中的转录水平显著高于年轻脂肪细胞(图2B和图S2A)。在成年脂肪细胞中，细胞质和细胞核中均存在IRF7，在受到干扰素刺激后，IRF7发生磷酸化并转移到细胞核中(图S2B-E)。在儿童中，超重和肥胖（体重指数标准差评分超过1.28）会显著上调脂肪组织Irf7 的转录水平，但Irf3无明显变化（图2C），并且肥胖的人类脂肪细胞中IRF7蛋白和IFN-β水平上调（图2D和图1H）。这些结果表明IRF3是组成性表达基因，而IRF7是一种ISG（干扰素刺激基因）。此外，IRF7在 IFN-β 肥大性脂肪细胞中表达水平上调的现象进一步支持了这一观点，而使用特异性IFN-β抗体来中和IFN-β能够降低体外脂肪细胞中IRF7蛋白的表达水平（小编注：IRF7是一种干扰素刺激基因(Interferon-stimulated genes, ISG)，能够被干扰素诱导表达，因此当干扰素水平被下调后，IRF7水平也降低了）(图S2F)。

无论IRF3是否存在，IRF7在诱导干扰素反应中均发挥着重要作用；但在没有IRF7存在的情况下，IRF3介导的干扰素反应水平显著降低，因此，年轻脂肪细胞中胞质mtRNA无法诱导干扰素反应可能是由于年轻脂肪细胞缺少IRF7。因为免疫环境和细胞类型也会影响IRF7在干扰素反应中发挥的作用，因此，需要确定IRF7在脂肪细胞干扰素反应中可能发挥的作用。

        通过使用高通量测序技术探究幼龄和成年小鼠iWAT的转录图谱时，研究人员发现一个IRF7相关的基因网络在成年脂肪细胞中高度表达(图2E和图S2G)。这个基因网络包含ISGs、编码炎症小体成分和IFNs的基因(图2E)。在这个IRF7相关的基因网络中，表达量最多的基因包括Aim2、Ddx41、Zbp1和Ifi205，这些基因对干扰素反应的发生都是必不可少的(图2F)。Aim2编码黑色素瘤中缺失的干扰素诱导蛋白2(Absent in melanoma 2, AIM2)，该蛋白负责胞质DNA炎症小体组装(图2F)；Ddx41编码DEAD盒螺旋酶41(DEAD-box helicase 41, DDX41)，能够识别胞浆B-DNA构象并刺激干扰素反应(图2F)。Zbp1编码Z-DNA结合蛋白1(Z-DNA-binding protein 1, ZBP1)，ZBP1也被称为DAI45，能够识别胞浆中具有转录活性的普遍DNA存在形式(图2F)，而胞浆中的具有转录活性DNA普遍以Z-DNA构象的形式存在。Ifi205编码干扰素-γ诱导蛋白205(IFN-γ-inducible protein 205, IFI205，人类IFI16蛋白的鼠源等效物），能够识别胞浆中的B-DNA构象并刺激干扰素反应（图S2H)。

在研究人员测定的脂肪组织、肝脏和肌肉组织中，仅脂肪细胞中IRF7相关的基因网络有变化，且成年脂肪细胞中表达较高（图2G，图S2I-K）。与成年脂肪细胞相比，年轻脂肪细胞中AIM2、DDX41、IFI205和ZBP1蛋白表达水平降低(图2H)，而在成年的脂肪细胞中，这些蛋白存在于细胞的核周区和细胞质中(图2H)。Aim2、Ddx41、Zbp1、Ifi205和IRF7的启动子区域均包含IRF7结合序列(图S2L)，说明这些基因的诱导转录依赖于IRF7(图2I)。肥胖儿童脂肪组织中IRF7相关的ISG编码转录本，如IFI16、ZBP1和TMEM173(STING1)水平上调(图2K)，这说明脂肪组织中IRF7水平也出现上调(图2C)。

有趣的是，该IRF7相关基因网络的主要功能是启动IFN对胞质DNA的反应，而不是对胞质dsRNA的反应。在年轻的脂肪细胞（图2J）和缺乏IRF7表达的脂肪细胞（图S2M）中，胞质DNA均无法激活IFN反应。又因mtRNA外排是由于mtDNA泄露到细胞质，因此年轻脂肪细胞可能通过IRF7相关基因网络免受mtDNA的免疫反应。

总之，这些发现表明，年轻脂肪细胞通过抑制IRF7相关基因网络来抑制IFN反应，使其免受胞质mtRNA诱发的免疫反应。

图2.IRF7是脂肪细胞胞质mtRNA诱发IFN反应的关键因子

为进一步阐明IRF7在脂肪细胞发育过程中的作用，研究人员发现缺乏Irf7的小鼠皮下脂肪组织中富含米色脂肪细胞，UCP1表达水平增加，且形态与棕色脂肪组织相似（图3A）。而成年小鼠的棕色脂肪组织缺乏Irf7，能够免疫胞质Poly(dA：dT) 诱发的IFN反应（图S3A和图S3B），这与之前研究发现小鼠棕色脂肪组织中先天免疫反应被抑制的研究结果一致（小编注：2021年的Cell中对iWAT和BAT的免疫信号基因表达水平进行研究，发现BAT中巨噬细胞基因表达明显降低，而在iWAT成熟过程中炎症通路过表达、炎症基因表达水平上调，此外2020年的一篇文章发现BAT中促炎因子和促炎基因表达水平降低）。

米色脂肪细胞能够通过产热消耗储存在脂肪中的能量，进而减少身体中储存的脂肪含量。Irf7基因敲除小鼠富含产热脂肪细胞，这一结果与先前发现的Irf7基因缺陷小鼠可以免受肥胖结果一致。在敲除Irf7的脂肪细胞中，核编码SDH-A水平上调(图3B)，说明线粒体有丝分裂增加（小编注：SDH-A基因编码琥珀酸脱氢酶的一个主要催化亚单位，其表达水平上调表明TCA循环过程上调，从而驱动细胞代谢加速细胞分裂）。此外，敲除Irf7的脂肪细胞能够免疫由胞质mtRNA引发的Ifnb反应对自身的影响(图3C)。值得注意的是，幼鼠的腹股沟脂肪组织富含米色脂肪细胞，且上调影响产热分化的特异性基因表达(图S4B-E)。与青少年(16-17岁)分离的脂肪细胞不同，瘦儿童(1-4岁)的脂肪细胞能够免受胞浆mtRNA诱发的IFN反应的影响，并表达UCP1(图3D和图3E和图S4F)。

综上所述，在年轻脂肪细胞中胞质mtRNA无法诱导INF-β的合成，缺乏IRF7时胞质mtRNA同样无法启动INF-β的合成，该现象也与产热脂肪细胞表型相关。在小鼠中，产热脂肪细胞先天性缺乏Irf7，而肥胖能上调人源脂肪细胞Irf7的水平。

因此，研究人员假设胞质mtRNA可能在形成产热细胞过程中发挥作用。接下来，研究人员进一步探究胞质mtRNA对年轻脂肪细胞线粒体产热基因和有丝分裂相关基因表达的影响。结果发现，胞质mtRNA强烈激活Ucp1和米色脂肪生物合成相关基因的表达（图3F），其中包括： Ppargc1ɑ、Cidea和Dio2。但在年轻脂肪细胞中，这些基因能够在表达水平上调的同时不诱发免疫反应。（图1C）。最终，胞质mtRNA促进了脂肪细胞有丝分裂过程，上调了脂肪细胞的线粒体含量，刺激线粒体产热（图3F和图3G）。同样，胞质mtRNA也上调了瘦儿童脂肪细胞有丝分裂、线粒体含量和产热作用（图3H），但对青少年脂肪细胞没有影响（图3I）。

胞质mtRNA可能通过激活RIG-I和MDA5信号通路发挥作用。RIG-I和MDA5的激活物能够上调脂肪细胞中米色脂肪生物合成相关基因的转录水平（图3J和图S5A-C），而在缺乏RIG-I或MDA5的脂肪细胞中，胞质mtRNA不能诱导米色脂肪基因表达（图3J）。胞质单链RNA或细胞膜相关Toll样受体3（Toll-like receptor 3, TLR3）的刺激均不能模拟胞质mtRNA对米色基因转录的增强作用（图S5D和图S5E）。这些结果表明，只有胞质双链RNA分子可以诱导从线粒体到细胞核的逆行信号，进而增强脂肪细胞的有丝分裂过程，此外mtRNA分子中富含的双链基序也进一步证实了mtRNA在细胞质中的信号传递作用。通过mtRNA或合成配体激活RIG-I和MDA5能够刺激Il6的表达（图S6A），这是一种已知的产热脂肪细胞发育自分泌-旁分泌信号（图S6B、图S6C、图S6E）。因此，抑制IL-6信号传导可以减弱mtRNA对米色脂肪生物合成的促进作用。

值得注意的是，RIG-I或MDA5的缺失会抑制脂肪细胞中的核编码线粒体SDH-A的表达（图3J），这表明mtRNA缺失会影响从线粒体到细胞核的信号传递。同时，RIG-I或MDA5的缺失导致了幼龄小鼠米色脂肪细胞的功能抑制（图3K）。因此，胞质mtRNA通过刺激有丝分裂发生和线粒体产热相关的核编码转录产物的表达来刺激年轻脂肪细胞中米色脂肪的生物合成。

图3.胞质mtRNA诱导米色脂肪细胞的发育

年轻脂肪细胞和产热脂肪细胞均缺乏IRF7，并免受胞质mtRNA诱导的IFN-β反应。因此，抑制IRF7可能是促进mtRNA介导脂肪细胞代谢中发挥有益作用的关键。所以接下来还需探讨年轻脂肪细胞中抑制IRF7表达的潜在机制。

已有文献报道，维生素D受体（VDR）能够抑制由胞质RNA诱导的IRF7表达和IFN反应。高通量测序技术分析显示，VDR调控的基因网络在年轻脂肪细胞中表达水平显著上调（图4A）（图4B）。此外，Camp（VDR靶基因）在年轻脂肪细胞中高表达，该基因编码脂肪组织富含的抗菌肽Cathelicidin（图4B）。相比之下，VDR抑制基因Coro1a（编码冠状蛋白A1）在年轻脂肪细胞中的转录水平较低（图4B）。胎儿脂肪组织在出生前就积累了维生素D，因此，维生素D代谢酶的转录有利于维生素D3（Vit-D3）的储存和VDR激动剂骨化三醇在年轻脂肪细胞中的合成（图4B和图4C）。

此外，幼龄小鼠脂肪组织富含维生素D3(Vit-D3)，并且VDR蛋白在年轻脂肪组织中的表达水平高于成年脂肪组织(图4C)。不仅如此，胞质dsRNA和mtRNA上调脂肪细胞中骨化三醇合成基因Cyp27b1的转录水平，并促进了脂肪细胞中Vit-D3与骨化三醇之间的转化(图4D)，所生成的Vit-D3能够有效抑制小鼠和人类脂肪细胞中VDR依赖性的Irf7转录（图4E）。当抑制VDR信号通路时，mtRNA可诱导Ifnb转录上调（图4F），而Vit-D3能够抑制这一作用，并且使用核因子NF-κB的抑制剂处理脂肪细胞能够产生类似于Vit-D3的作用效果（图4G）。同样地，Vit-D3也能够抑制成年人类脂肪细胞中由胞质mtRNA诱导的IFN-β的产生（图4G）。

图4VDR降低年轻脂肪细胞中IRF7表达水平

抑制幼龄小鼠的VDR信号通路会减少脂肪组织中米色脂肪细胞 (图4H)，并上调脂肪细胞中IRF7蛋白水平(图4I)。儿童脂肪组织中IRF7表达水平的升高(图2C)和IRF7靶基因的表达上调(图4J)会导致脂肪组织中VDR控制的基因网络表达受损和激活Vit-D3的CYP27A1表达水平降低，进而导致儿童肥胖(图4J)。与之相类似的是，饮食诱导的肥胖会上调小鼠脂肪组织中IRF7的水平，并下调VDR的表达(图5A)。总而言之，上调IRF7会抑制VDR信号，促进肥胖的发生。

接下来，研究人员构建了一种模拟儿童肥胖症的小鼠模型，该模型使用高脂饮食(HFD)喂养的母鼠（刚产下后代）(图5B)。饲喂HFD的母鼠后代的脂肪细胞VDR表达水平下调，IRF7表达显著上调(图5C)，其皮下脂肪组织中缺乏米色脂肪细胞(图5D)。最终，饲喂HFD的母鼠后代出现肥胖表型和脂肪细胞中线粒体受损（图5E），炎症小体被激活，这些结果表明脂肪组织出现炎症(图5D)。用Vit-D3治疗可以改善这些不良症状，恢复幼龄小鼠的米色脂肪细胞含量（图5F），减轻肥胖和脂肪细胞炎症（图5G）。

而在饲喂HFD的成年小鼠中，将胞质mtRNA递送至腹股沟脂肪组织库中，同时结合Vit-D3治疗，能够降低IRF7水平(而非IRF3水平)并上调米色脂肪细胞含量(图5H和图S7A)，减轻肥胖和脂肪细胞炎症，促进线粒体质量、产热水平和能量消耗的上调(图5H-J和图S7B、图S7C和图S8)。

图5.mtRNA结合Vit-D3治疗对饮食诱导的肥胖的影响