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撰文|马莹 郭明伟 张俊 仲银召 闪光余
编辑| 孟美瑶
校对| 张俊
背景介绍
众所周知,有规律的运动能够预防并治疗肥胖和糖尿病。研究运动益处的分子机制能帮助我们鉴定出有效的生物标志物和治疗靶点。然而,运动产生的效应涉及一系列复杂的生理过程,包括通过改变关键基因和蛋白质的表达来促进不同器官系统的改善性适应,因此研究具体的分子机制是一项极具挑战性的工作。本文作者假设运动效益是通过直接影响单个组织内的不同细胞类型和调节组织内/组织间的通讯而发生的。在本文中,作者利用最新的单细胞技术和计算生物学方法,在分子、细胞类型特异性和跨组织水平上同时研究机体响应运动和肥胖的过程。
白色脂肪组织(WAT)和骨骼肌(SkM)是最易受到肥胖和运动影响的内分泌器官,因此二者一直是组织水平研究的重点。皮下和内脏白色脂肪(scWAT和vWAT)是两个主要的白色脂肪库。两种WAT都由成熟脂肪细胞和基质血管组分(SVF)组成。其中,基质血管组分包括脂肪干细胞(ASCs)和多种免疫细胞。SkM的细胞组成也是具有高度异质性,它由结缔组织包围,其组分包括肌纤维、间充质干细胞(MSCs)、卫星细胞、成纤维脂肪祖细胞(FAPs)和免疫细胞等。目前,许多研究利用单细胞或单核RNA测序解析了肥胖、冷刺激或β-肾上腺素处理下WAT的异质性细胞组成,但几乎没有对运动干预后的分析。此外相比于WAT,单细胞测序对SkM的解析存在着局限性,并且现有研究多聚焦于SkM的细胞类型表征和组织再生。尚未有研究在单细胞层面解析运动对多组织对抗肥胖的有益影响。
在本文中,作者在单细胞和多组织层面解析了scWAT、vWAT、SkM中运动训练和饮食诱导肥胖的相反效果,并且提供了一个在代谢组织中肥胖-运动单细胞变化图谱,同时揭示了MSCs为响应肥胖和运动干预而介导组织特异性和组织间交流变化的重要作用。
敲黑板啦!
1. 在两种白色脂肪组织和骨骼肌种解析运动-肥胖的单细胞图谱;
2. 运动和肥胖对MSCs的ECM和昼夜节律基因有着相反影响;
3. 运动和肥胖的组织内和组织间交流以MSCs为中心;
4. MSCs中具有较大运动效应的基因与人类代谢特征相关。
研究结果
1. 饮食诱导肥胖和运动的表型及三种代谢组织的特征分析
作者利用HFD诱导6周龄的C57BL/6N雄性小鼠肥胖,并且进行自主跑轮运动干预(图1A)。在表型上,HFD小鼠体重增加并表现葡萄糖不耐受(图1C和1F)。虽然HFD没有显著影响跑步距离(图1D),但HFD小鼠摄入更多的卡路里,尤其是在不运动的时候(图1E)。并且对于组织和单细胞水平的相关性分析也证明了以上结果(扩展图1A-1F)。随后,作者收集以上小鼠的scWAT、vWAT和SkM并进行转录组学分析。
图1| 研究概述、突出结果和表型反应
扩展图1 | Bulk和单细胞小鼠队列的表型,样本聚类,以及跨表型比较的组织水平转录组变化相关性
2. 三种组织中肥胖引起的组织水平基因和通路改变
作者在三种组织中发现了1386个组织水平差异表达的基因(DEGs)(scWAT中568个,vWAT中56个,SkM中256个),并进行分组,分别为肥胖组(HFDvs标准饮食的久坐)、训练组(标准饮食的运动训练vs久坐)以及抵抗肥胖组(HFD的运动训练vs久坐,文中为rescue组)。GO富集分析和蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)分析揭示了干预和组织中共同和不同的生物学过程(图2A-2D)。
通过比较肥胖组与训练组/抵抗肥胖组的两种脂肪中的DEGs得到DEGs子集,发现其中几乎所有(94%-95%)的DEGs都源于肥胖组与训练组/抵抗肥胖组的相反变化(图2A-2B)。这个负相关性发生在所有基因中(不止在DEGs中),肥胖组与抵抗肥胖组在两个脂肪库中都表现出负相关性,并且在vWAT中,肥胖组和训练组成负相关性(扩展图1G)。脂肪库DEGs包括已知的和研究较少的代谢相关基因,后者包括训练组/抵抗肥胖组上调的昼夜节律调节因子(Dbp, Tef, Nr1d2和Per3)以及训练组/抵抗肥胖组下调细胞外基质(ECM)重塑基因(Thbs1 和Sparc)(小编注:细胞外基质(Extracellular matrix)是由胶原蛋白、蛋白聚糖/糖胺聚糖、弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白和其他几种糖蛋白组成的非细胞三维大分子网络。),对于SkM(图2C),抵抗肥胖组/训练组上调51种基因,下调20种基因,包括脂肪代谢抑制物pkd4和肌肉量抑制物Asb2。抵抗肥胖组相比于训练组表现出更多的DEGs,表明了相比于标准饮食,在HFD条件运动对骨骼肌的影响更大。
在三种组织中,DEGs可以聚类成具有生物学意义的相互作用的蛋白模块(modules of interacting proteins)(图2D和扩展图2)。抵抗肥胖组/训练组上调了脂肪酸生物合成/β氧化,以及细胞呼吸的模块,包括氧化磷酸化,三羧酸循环和活性氧反应。抵抗肥胖组/训练组下调了免疫模块,包括抗原呈递,中性粒细胞脱颗粒,免疫细胞迁移,吞噬体相关基因以及与ECM和细胞增殖相关的模块。扩展图2总结了每种干预对组成每个模块基因的影响,例如Cdkn1a(编码参与细胞衰老的蛋白)在抵抗肥胖组的scWAT和vWAT中是下调的(扩展图2)。这些组织水平的结果揭示了介导许多运动训练有益结果的特定基因和通路。
图2 | 多种组织的转录组
图S2 | 组织水平蛋白-蛋白相互作用网络
拓展阅读:细胞外基质重塑
细胞外基质(ECM)是由胶原蛋白、蛋白聚糖/糖胺聚糖、弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白和其他几种糖蛋白组成的非细胞三维大分子网络,存在于所有组织中,对生命至关重要。ECM是一种高度动态的结构,并不断经历重塑以维持组织稳态,ECM重塑失调会导致许多疾病,包括纤维化和癌症,该过程涉及ECM的定量和定性变化,由负责ECM降解的特定酶(例如金属蛋白酶)介导。ECM组分的裂解是ECM重塑过程中的主要过程,对于调节ECM丰度,组成和结构以及释放生物活性分子(如生长因子)非常重要。ECM可以被不同的蛋白酶家族切割。基质金属蛋白酶(MMP)是参与ECM降解的主要酶,它以可溶性或细胞膜锚定蛋白酶的形式产生,以广泛的底物特异性裂解ECM成分。重塑ECM的一个有效策略是去除其中的一个或多个成分,这在组织重塑过程中是必要的,例如昆虫和两栖动物的变态或乳腺退化,这种情况下大块组织被新组织所取代;另一个有效策略是调控组装在蛋白质网络中的ECM成分的水平和组织,例如间质胶原蛋白会受到很多翻译后修饰,包括共价和非共价交联,赖氨基氧化酶(LOX)和赖氨酰羟化酶都决定了胶原蛋白和弹性蛋白之间的分子交联程度。过量的LOX活性会上调胶原蛋白交联,增加组织拉伸强度和基质刚度,并且可以改变各种细胞行为。在转录水平上,ECM重塑酶的表达受到严格控制,以便它们在特定时间在特定细胞中产生,例如,果蝇MMP-2在早期果蝇胚胎中特异性表达足以促进气管分支形态发生,同样,MPP-2和MPP-3活性是青春期后雌性小鼠乳腺机体上皮迁移所必需的;在转录后水平上,ECM重塑酶将移动到特定的亚/细胞外位置,例如MMP和其他蛋白酶已被证明在侵入性伪足中特异性定位,这是一种被认为参与细胞迁移的特殊细胞延伸,被认为参与细胞迁移,同样,由破骨细胞表达的组织蛋白酶K积聚在细胞的基底侧,这种定位允许组织蛋白酶K在最佳局部微环境中发挥作用,并确保骨基质的有效降解和再吸收。
参考文献:
[1] Lu P, et al. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2011 Dec 1;3(12):a005058
[2] Bonnans C, et al. Nat Rev Mol Cell Biol. 2014 Dec;15(12):786-801.
3. 在肥胖和运动条件下的代谢组织中的单细胞图谱
除了组织水平数据集,作者还在三个组织和四个干预组的肥胖-运动相互作用中解析了204883个细胞的单细胞图谱(图3A)。为了捕获低富集度细胞类型(如WAT中的ASCs,SkM中的FAPs),研究人员使用了富含基质血管部分(SVF组分)构建单细胞文库。此外,研究人员为了探究组织和淋巴结之间的免疫细胞迁移,他们在分析scWAT时还将淋巴结包括在内。
作者利用非线性嵌入的方法进行降维(tSNE和UMAP),最终根据细胞亚群中表达的标记基因而鉴定出22种细胞类型。这些包含了(1)3种干细胞,包括ASCs,卫星细胞和FAPs;(2)10种来自淋巴和髓系的免疫细胞;(3)2种结缔组织细胞,包括SkM中的腱细胞(tenocytes)和主要在vWAT中的成纤维细胞;(4)两种类型的肌肉细胞,包括肌纤维和平滑肌细胞;(5)4种其他类型细胞:内皮细胞、上皮细胞、附睾细胞、胶质细胞(图3A)。此外,作者还展示出各种细胞类型的组织来源和两种干预方式对以上细胞类型都具有一定影响。亚聚类分析表明以上细胞类型中的11种具有42种细胞亚型,包括3种ACSs状态,即间质祖细胞(IPC),保守的前体脂肪细胞(CP)和CD142+ASC(扩展图3A)。
图3|单细胞图谱和间充质干细胞状态表征
4. 脂肪库特定ASC状态的分子特征
接下来,研究人员评估了WAT中ASC的转录多样性作为分化潜能的标志(图3D)。这一概念在CytoTRACE(小编注:Cellular (Cyto) Trajectory Reconstruction Analysis using gene Counts and Expression是一种利用单细胞RNA-SEQ数据预测细胞分化状态的计算方法,CytoTRACE利用了一个简单但强大的发育潜力决定因素——每个细胞可检测表达的基因数量,或基因计数)框架中得到了证明,该框架表明在分化过程中转录多样性降低。对于vWAT,研究人员证明了IPCs表现出转录多样性增加,这和IPCs早期的分化状态一致。然而在vWAT中,CPs和CD142+细胞也表现出转录多样性增加,这可能与它们的米色转分化和去分化的潜能相关。随后,作者进行了拟时序分析,并根据先前的实验证据选择了轨迹起点(IPC),预测的时序描绘了两个WAT库中从IPCs到CPs和CD142+细胞的轨迹(扩展图3B)。
拓展阅读:脂肪细胞的去分化和转分化
现在有证据表明,脂肪细胞可以进行去分化,它们能够恢复到成纤维细胞样的前体状态。有研究指出,愈合性皮肤损伤,纤维化皮肤,肿瘤基质和泌乳乳腺中的成纤维细胞来自脂肪细胞谱系。在伤口愈合和哺乳的情况下,脂肪细胞的去分化是可逆的,并且由脂肪细胞去分化产生的成纤维细胞能够重整脂肪细胞。尚不清楚这些成纤维细胞的脂肪细胞前体在多大程度上仅局限于脂肪细胞谱系,以及它们是否能够在体内形成其他细胞类型。
然而,对控制脂肪分化可逆性的机制的理解可能会为某些恶性肿瘤提供关键的治疗思路。脂肪肉瘤是类似于脂肪细胞和脂肪前体的恶性肿瘤,其中恶性肿瘤的数量与肿瘤组织中分化良好的脂肪细胞的数量成反比。其他类型的癌症,例如血肿和血管瘤,也包含处于各种分化状态的脂肪细胞。因此,对什么分子信号促进或维持脂肪去分化的更深入的了解可以为抗癌疗法以及潜在地控制脂肪细胞的数量以促进体重减轻提供新的途径。
其次,脂肪细胞也可以进行转分化,有研究发现脂肪细胞在怀孕和哺乳期间转分化为乳腺腺体和乳腺肺泡细胞。哺乳后,这些乳腺上皮细胞进行反向转分化并成为脂肪细胞。在怀孕和哺乳期的小鼠皮下脂肪库中,有第三种类型的脂肪细胞,粉红色脂肪细胞,这里的粉红色脂肪细胞即是乳腺肺泡上皮细胞,其作用是产生和分泌乳汁,粉红色脂肪细胞也是源自皮下白色脂肪细胞的转分化。
脂肪器官对一系列代谢和环境挑战的功能反应突出了其非凡的可塑性。在细胞水平上,可塑性不仅通过干细胞的增殖和分化而提供,而且还通过诱导基因表达重新编程的刺激直接转分化完全分化的脂肪细胞,并通过其改变表型和功能。
参考文献:
[1] Ghaben AL,et al. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019 Apr;20(4):242-258.
[2] Wang QA, et al.Cell Metab. 2018 Aug 7;28(2):282-288.e3.
[3] Giordano A, et al. Eur J Endocrinol. 2014 Apr 10;170(5):R159-71.
研究人员为每个ASC状态寻找共表达的调节因子/靶基因组合(调节子),以深入了解其基因调控回路。他们确定了脂肪库(即vWAT和scWAT)共有的以及脂肪库和细胞状态特异性的调节子。脂肪库共有的调节子(图3E,蓝色)包括已知IPCs的调节子Klf3和Creb5,在脂肪生成过程中很早就被激活,CPs的调节子Cebpa,Pparg和 Gsc,其中Cebpa和Pparg是诱导终末分化过程的两个主要脂肪生成因子。而对于CD142+细胞,则是由甲状腺激素受体β(Thrb)控制的调节子。对于脂肪库和细胞状态特异性调节蛋白,scWAT中IPC表达最高的Irx3(在CPs中最低)促进早期脂肪细胞分化。在vWAT的pre-CPs(一种介于IPCs和CPs之间的状态)中,研究人员确定了两个潜在的IPC到CP谱系指定调节子,Foxc1与祖细胞状态维持有关,Nfil3与昼夜节律脂质代谢程序有关,并调节脂质吸收和输出。总的来说,研究人员的单细胞数据突出了不同ASCs亚群的脂肪库共有的和脂肪库特异性基因调控回路,并使vWAT中ASC早期分化的调控预测成为可能。
拓展阅读:昼夜节律
昼夜节律(意思是“大约一天”)行为在生活中的大部分时间里都发挥着作用。动物、植物甚至细菌都表现出遵循近24小时节奏的行为模式。每个细胞都有一个基因编码的分子系统,通过一个严格控制的基因和蛋白质网络来指导这些模式,这些基因和蛋白质的浓度在每天的周期中振荡。在哺乳动物中,昼夜节律系统的中枢起搏器是下丘脑内的视交叉上核(SCN),并通过接收来自眼睛光信息的视网膜下丘脑束定向到外部环境,负责协调生物体的日常和季节性节律,可在昼夜周期的24小时内适应性地协调生理和行为的变化,它同步了睡眠-苏醒周期的许多特征。在这里新陈代谢,环境和遗传输入被整合在一起,以产生整个生物体的周期(也称为τ)或昼夜节律周期的长度,表现为许多行为和生理模式。该时钟(位于SCN中的中枢起搏器)是细胞自主的,以其最简单的形式由转录-翻译振荡器环路组成,该振荡器的核心是碱性螺旋环螺旋PER-ARNT-SIM(PAS)结构域蛋白BMAL1(也称为ARNTL)和CLOCK的异二聚体关系,它们结合E-box位点并诱导阻遏物Period(PER)和Cryptochrome(CRY)的表达,阻遏物及时易位回细胞核并通过干扰BMAL:CLOCK复合体来抑制自身表达。BMAL-CLOCK异二聚体还可以调控其他节律基因的表达,如Rev-Erb, RoR等。ROR与REV-ERB可易位进入细胞核内激活或抑制Bmal1的转录。随着PER和CRY蛋白逐渐降解,BMAL1和CLOCK的抑制得到缓解,循环以另一个24小时周期重新开始,该机制位于SCN生物钟的核心。
参考文献:
[1] Curtis AM, et al. Immunity. 2014 Feb 20;40(2):178-86.
[2] Gentry NW, et al. J Clin Invest. 2021 Aug 16;131(16):e148282.
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5. SkM中七种不同的FAP状态和新型的FAP亚群
研究人员利用小鼠和人类标记物将55000个FAPs分类成7种不同的细胞状态:(1)多能IPC_SkM,其标记物与WAT中的IPC一致;(2) FAP_Cxcl14+;(3)FAP_Prg4+;(4)和CD142+细胞相似的脂生成调节细胞FAP_CD142+(5)FAP_post_injury代表一种受伤后的炎症状态;(6)中胚层细胞(Ds),由Alpl+标记;(7)一种之前未报道的FAPs的Scal1亚群(扩展图3C)。前六种亚型均为Pdgfra, Cd34和 Ly6a阳性(扩展图3D)。所有七种亚型在之前的单细胞数据中都被检测到了(扩展图3E) 。
虽然FAP通常被典型标记Pdgfra+、Cd34+和Sca1+来定义(小编注:成纤维脂肪祖细胞(FAP)是一种驻留在骨骼肌中的多能间充质干细胞,其标志物是Pdgfra、Cd34和Sca1,具备分化为脂肪细胞,成纤维细胞或骨细胞的潜能。在正常状态中下,FAP是维持骨骼肌稳态的必要因素。在肌损伤中,FAP可募集免疫细胞并诱导肌肉再生。然而在肌萎缩状态或肌肉持续性损伤中,FAP的成脂和成纤维化的分化潜能将导致骨骼肌的脂肪浸润和纤维化,进一步加剧疾病进程。脂肪SVF中则存在一类名为纤维炎性祖细胞(FIP)的脂肪干细胞亚群,目前仅在内脏脂肪(eWAT)中鉴定出这类细胞亚群。虽然该亚群表达干细胞标志物Pdgfrβ和Ly6C,但同时高表达胶原基因,并具有促炎和抑制成脂分化的功能),但研究人员发现了一种FAP亚群是Sca1阴性(扩展图3D)。前人研究表明,在细胞沿着特定谱系分化时,SCA1被下调。根据CytoTRACE 分化预测,Sca1-FAPs相比于Sca1+FAPs表现出更高的分化状态(更少的转录多样性)(图3F,扩展图3C)。此外,Sca1-FAP表达高水平的胶原蛋白基因,这是泛成纤维细胞标志物,Sca1-FAP还表达IL33,其具有在非淋巴组织中募集Tregs和ILC2对抗炎症的作用(扩展图3F)。因此,研究人员假设Sca1-FAPs是从MSCs分化而来的成纤维祖细胞亚群。他们通过FACS验证了肱三头肌和腓肠肌的Sca1- FAPs,qPCR检测证明Sca1- FAPs的基因表达模式明显区别于Sca1+FAPs,并且缺乏内皮细胞(Pecam1)、腱细胞(Scx)或胶质细胞标记物(Plp1)的表达(图3G,扩展图3G-H)。作者利用免疫荧光染色可视化Sca1-FAPS(图3H和3I)。此外,这种FAP和之前报道的心脏中的心肌纤维化SCA-1细胞亚群相似(扩展图3I),这个亚群从 PDGFRα+ SCA-1+细胞分化而来。这种SCA-1亚群在心肌梗死后增加,在心律失常性心肌病中具有致病作用。然而,在训练组中Sca1-FAP丰度有一个降低的趋势,作者推测运动训练通过作用于Sca1-FAP下调了SkM的纤维化。
然后作者对七种FAP进行了基因富集分析(图3J),七种FAPs状态的共同通路包括核心基质小体、基质小体相关、IGF运输和摄取以及衰老过程,表明了FAP在SkM中对于ECM,IGF信号中的关键作用(图3J和3K)。在Sca1-FAP中,作者发现了IL-6介导的信号通路以及Mafg和Cebpg调节子,它们参与IL-6诱导的氧化应激反应,突出了这个亚群对于IL-6这个由肌肉收缩释放的因子的更多功能。
扩展图3 | 三种组织中的单细胞亚型/状态注释和骨骼肌中的纤维脂肪祖细胞验证和表征
6. 三种组织中由肥胖和运动引起的细胞类型和细胞状态比例的变化
作者也还使用独立的单细胞图对组织水平数据进行了去卷积(小编注:去卷积是空间分辨转录组学实验分析的关键步骤之一,用于估计混合物(数据点)中每种细胞类型的比例以及每个细胞的基因表达水平(在同一数据点内)的算法),该图通过人工筛选进行了细化。结果去卷积捕获了主要的高富集的细胞类型,作者利用这些组织去卷积的结果表征之前提到的三种干预比较中(肥胖组、训练组、抵抗肥胖组)细胞类型比例的变化。在两种脂肪组织中(scWAT,vWAT),HFD诱导的肥胖显著降低了成熟脂肪细胞的比例,增加了ASCs和髓系细胞的比例(图4A和4B),这和在肥胖相关的代谢下降中脂肪细胞的坏死和巨噬细胞的浸润的增加一致。运动训练逆转了HFD中这些效果,但是在标准饮食条件下单独训练并没有此种效果。两种WAT库中的组织学染色表明了肥胖显著增加了成熟脂肪细胞的尺寸(脂肪细胞肥大),这些效果都被训练所逆转(抵抗肥胖组图4D和4E)。在SkM中,训练组和抵抗肥胖组降低了Ⅱ型肌纤维数量,增加了FAPs,髓系细胞和内皮细胞数量(图4C)。
作者还利用单细胞结果标注细胞亚型/状态比例的变化(扩展图4A-4D)。在干预WAT后,ASCs、巨噬细胞和T细胞是细胞亚型/状态比例变化最大的细胞类型。在肥胖组中,研究人员发现这些变化在vWAT中特异发生,伴随着CD142+细胞的增加,这与之前的结果一致。抵抗肥胖组再一次逆转了这个变化,减少了vWAT中的CD142+细胞(扩展图4B)。除了ASCs,肥胖组增加了巨噬细胞的比例和vWAT中M1(促炎)与M2(抗炎)的比值(扩展图4C)。但抵抗肥胖组将M1/M2的比值恢复到基准线水平。在肥胖组的淋巴细胞谱系中,Tregs的比例增加了,而NKT的比例下降了,这两种改变仍旧在抵抗肥胖组中被逆转。此外,Treg和NKT细胞在训练组中具有相似的变化,表明了运动训练对淋巴细胞产生的有益作用与饮食无关。在SkM中,Sca1−和Sca1+ FAPs的比例因训练而表现出降低的趋势,这就表示训练组改善了SkM的生理学并且降低了炎症和纤维化的发生概率(扩展图4D)。
7. 细胞类型特异性转录组学变化突出了三种组织间充质干细胞的ECM重塑和昼夜节律基因表达
接下来,作者使用单细胞数据来推断肥胖和运动训练干预所调节的细胞状态特异性和细胞类型特异性基因表达变化。在WAT中(图4F和4G),作者在细胞状态水平上发现139个scWAT DEGs和502个vWAT DEGs,主要影响ASCs,其次是两个WAT库中的T细胞。在ASCs中,IPCs和CPs中的DEG分别占scWAT的57%和vWAT的59%,这表明IPCs和CPs是ASC中对干预措施响应最活跃的两种细胞状态。在这两个脂肪库中,vWAT受肥胖组影响最大,显示DEGs富集7.6倍(265:35)。在vWAT中,抵抗肥胖组逆转了ASC中12%的肥胖调节基因,但对T细胞并没有影响,这表明肥胖诱导的免疫失调可能会持续更长时间。在SkM中,作者确定了290个DEGs(肥胖组13个+训练组74个+抵抗肥胖组203个)(图4H)。相比于肥胖组和训练组,抵抗肥胖组导致了更多的单细胞DEGs,这和组织水平的结果是一致的。Sca1+FAP显示出最多的DEGs,其中IPC_SkM和FAP_CD142+细胞占Sca1+FAP DEG的81%。细胞类型层面的DEGs在三种组织和三种表型的比较中显示出相似的基因表达变化模式。
三种组织中,在scWAT IPCs、四种vWAT ASCs状态和三种Sca1+FAP状态(IPC_SkM、FAP_CD142+和MAB)中ECM相关途径均在肥胖组上调,在训练组和抵抗肥胖组下调。已观察到肥胖组ECM在WAT中过度沉积,既为增大的成熟脂肪细胞提供结构支持,又促进组织纤维化。在SkM中,ECM对肌肉发育、生长、修复和运动中的机械支持至关重要。这些数据支持scWAT和vWAT中的ASC和SkM中的FAP在肥胖和运动背景下调节ECM重塑中的重要作用。
昼夜节律是三种组织中另一个值得注意的调节通路。这个通路在训练组和抵抗肥胖组中上调,而且在SkM中的FAPs和WAT中的ASCs中富集,表明了这些组织中运动和昼夜节律性的紧密联系(图4I-4K)。上游的调节子分析表明Dbp, Tef和 Hlf这三个同源PAR bZIP TFs有着共同基序,因此它们是特定MSCs状态下这些训练所改变的昼夜变化途径的潜在主要调节子。
8. 运动和肥胖在每个组织中调节的不同细胞类型特异性途径
在scWAT中,DEGs的通路分析表明,肥胖组降低了T细胞中的I型干扰素信号和防御反应,这表明从适应性免疫反应转变为炎症反应(扩展图4E)。抵抗肥胖组上调了ASCs中前列腺素合成和调节途径,将前列腺素降解基因Hpgd的表达下调了1.5倍(图4E)。Hpgd下调与前列腺素E2水上升平相关,这已被证明有助于维持ASC的自我更新能力和增强免疫调节能力(小编注:前列腺素与特异的受体结合后可介导细胞增殖、分化、凋亡等一系列细胞活动,在脂肪中其可参与脂肪细胞的增殖分化)。
在vWAT中,两条可能介导ASCs新生脂肪生成的途径在肥胖组上调,在抵抗肥胖组下调(扩展图4F)。一条是刺激TGFβ1(由肥大且功能失调的脂肪细胞分泌的抗脂生成的炎症分子)生成,已知会抑制小鼠和人类的脂肪细胞分化。另一种是ROS代谢过程,会促进ROS通过线粒体呼吸在细胞内积累,降低了脂肪前体细胞的分化并导致促炎和纤维化表型。
在SkM中,肥胖组上调了DCs(树突状细胞)中IL-8和细胞因子信号通路,抵抗肥胖组下调了FAPs中脂肪细胞的分化(扩展图4G)。据报道,在肌病和肥胖中,FAP成脂反应与异位脂肪沉积有关。抵抗肥胖组下调了脂肪细胞的分化(扩展图4D),这与增加的FAP CD142+一致,其抑制SkM中的脂生成。在SkM的免疫部分中,肥胖上调了传统2型DCs中的IL-18信号通路,这与炎症性肌病中DCs中IL-18的增加一致。
利用去卷积组织水平的数据确定的DEGs在肥胖组和训练组/抵抗肥胖组中的调节方向大多相反(扩展图4K-4M)。这两个脂肪库中丰富的途径包括成熟脂肪细胞中的脂质代谢、ECM相关途径以及ASCs和髓系细胞中的IGF转运和摄取(小编注:胰岛素生长因子(IGF)可促进细胞对氨基酸的摄取、蛋白质合成及细胞迁移等功能,在多种细胞中通过减少细胞凋亡而发挥生长因子作用。研究已表明,在ASCs中,IGF可促进ASCs向软骨细胞分化,而在髓系细胞中IGF的表达,可促进血管生成)、免疫细胞激活、炎症反应调节以及淋巴和髓系中的单核细胞趋化性。在SkM中,50个组织去卷积的DEG中有44个位于快肌(即II型肌纤维)核内。
图4 | 三种组织的单细胞水平比例和转录组反应
扩展图4 | 随着高脂饮食和运动训练,细胞状态比例、细胞类型特异性转录组学、调节蛋白活性和去卷积转录组学发生变化
9. 运动训练重编程组织内/间细胞通信
研究人员利用高分辨率的单细胞注释的优势,使用基于相互作用结构的配体-受体对的共表达来预测组织内和组织间的成对细胞通信,并在细胞类型和细胞状态水平上进行干预(图5和扩展图5)。
在组织内,作者观察到MSCs在肥胖组、训练组和抵抗肥胖组比较中作为免疫和非免疫细胞类型的自我调节和交叉调节中枢发挥作用(图5A-B,扩展图5A-B)。通过比较干预组重叠的显著相互作用的等级,研究人员观察到不同相互作用的网络,包括肥胖组上调的非免疫相互作用(scWAT中的ASC自分泌调节和vWAT中成纤维细胞-ASC相互作用)。RANK-RANKL-OPG三联体(小编注:RANK-RANKL-OPG信号通路在淋巴细胞分化、树突细胞存活、T细胞活化上都有重要影响。RANKL调控早期T、B淋巴细胞形成过程,尤其是在CD25+CD44-发展成CD25-CD44-,在B220+CD43-CD25-促B细胞发展成CD25-CD44-B220+CD43-CD25-前B细胞过程中起重要调控作用。RANKL/RANK还可协同CD40L/CD40信号通路一起调控骨髓胸腺上皮细胞的生成,骨髓胸腺上皮细胞能表达自身免疫调节基因及介导 T 细胞自身耐受。但是该三联体在脂肪中的功能仍不明确)在vWAT中对HFD和运动训练的反应中表现出特别的共表达模式变化(扩展图5A,5C和5D)。RANK是三种受体中的一种,由Tnfrsf11a编码,RANKL是配体,由Tnfsf11编码,OPG(骨保护素)是RANKL的诱饵受体,由Tnprsf11b编码。OPG主要在ASC IPC和成纤维细胞中表达,RANKL在nILC2s和CD27-Tgds中高表达,RANK主要在M2巨噬细胞中表达(扩展图5C)。肥胖组增加了成纤维细胞和IPCs中OPG的表达,增加了nILC2s中RANKL的表达,而训练组和抵抗肥胖组降低了OPG的表达(扩展图5D)。有趣的是,RANKL在CD27-Tgd中的表达和RANK在M2巨噬细胞中表达在肥胖组与训练组和抵抗肥胖组呈现相反的趋势。因此,研究人员假设,HFD促进了nILC2中RANKL与成纤维细胞和IPC内诱饵受体OPG之间的相互作用,相反,运动训练诱导了从这种配体-受体相互作用转变为来自CD27-Tgd的RANKL和来自M2巨噬细胞的和RANK的相互作用。
在各组织中,作者进行了稍有不同的比较,以突出肥胖和运动训练时WAT和SkM之间有生理意义的定向交流变化。具体来说,作者比较了在久坐状态或运动训练中,SkM和WAT介导肥胖效应(HFD与标准饮食)的配体-受体共表达。他们从WAT到SkM进行了类似的分析,比较了HFD或标准饮食下的训练效果(训练与久坐)。研究人员发现,与HFD久坐状态下的效应相比,HFD运动训练的效应降低了从SkM的非免疫细胞到vWAT的免疫细胞亚型的组织间通讯(小编注:通过生信分析发现二者之间存在的相应的配体-受体网络相互作用)(图5C-5D)。然而,在SkM和scWAT之间几乎没有这种交流。相反,与标准饮食的训练效果相比,HFD的训练效果下调了许多从vWAT的免疫细胞到SkM的非免疫细胞的交流(图5E-5F)。参与双向互动的SkM非免疫细胞状态主要是FAP状态,而免疫细胞亚型与接受来自训练时SkM的分子信号和HFD中SkM发送信号的有所不同(图5C-5F)。具体地说,就是训练下调了SkM FAP配体和vWAT中巨噬细胞和DCs上受体的共表达(图5C-5D)。MIF-CD74信号传递就是这样一种相互作用,在运动训练中,不同SkM细胞类型,包括FAPs到M1巨噬细胞和vWAT中的cDC1s和cDC2s的信号传递被下调,但其与M2巨噬细胞的相互作用略有上升(扩展图5E-5F)。反过来,HFD下调了vWAT中Tregs和nILC2s分泌的配体与SkM中FAPs上的相应受体之间的相互作用(图5E-5F)。vWAT中Tregs和nILC2s分泌的AREG及其在SkM中FAP上的受体EGFR表达被HFD共同下调(拓展图5G-5H)。总之,这部分表明运动可以促进SkM向两种WAT的交流(即SkM产生配体,通过体循环结合WAT的受体),但HFD会促进两种WAT向SkM的交流(即WAT产生配体,通过体循环结合SkM的受体)(小编注:虽然作者在原文中指出脂肪-肌肉间的交流是相互的,但实际上运动/肥胖效应只能促进某一组织向另一组织的单方面对话)。AREG-EGFR信号在许多疾病中通过调节成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化及其增殖,在伤口愈合中起着重要作用。作者推测运动训练可能通过调节vWAT和SkM之间的AREG-EGFR信号轴来抑制HFD诱导的SkM纤维化效应。然而有趣的是,尽管在vWAT中有表达MIF的细胞类型,在SkM中有表达AREG的细胞类型。但作者并没有检测到这两种配体-受体对(ligand-receptor pairs)由于运动的影响而在组织内发生显著变化,这说明了运动改善HFD诱导的SkM纤维化这一事件更可能是组织间交流而产生的影响,进一步说明了组织间交流的重要性。
图5 | 细胞状态水平的组织内和组织间通信
扩展图5 | 组织内和组织间通信
10. 两项独立的大规模人类研究中两个运动训练候选基因的遗传学特征
为了评估以上结果的人类相关性,作者在三个组织中选择了一个上调的基因和一个下调的基因,并在UK生物库(小编注:英国生物库(UKB)通过标准化流程,收集并长期储存人体生物样本(如血液和 DNA)及样本采集对象生理、病理、社会经济信息,本质上也是一种大样本的人群前瞻性队列研究)中测试了人体测量性状遗传关联,在男性代谢综合征(METSIM)研究中测试了人类代谢组织表达变化(图6A)。在18个普遍上调的基因中,研究人员选择了Dbp (小编注:Dbp,一种已知的昼夜节律靶基因,可以提高小鼠和人类vWAT的胰岛素敏感性并促进脂肪分化,还调节参与糖异生和脂肪生成的关键代谢基因的表达)(图6B),它是饮食/运动调节的昼夜节律途径中的关键调节子,其同源物Hlf和Tef也通过运动训练在MSCs中上调。在人类中DBP与体重指数(BMI)、胰岛素抵抗稳态模型评估(HOMA-IR)、空腹血清胰岛素和葡萄糖浓度、C-反应蛋白(CRP)和腰臀比(WHR)呈负相关,与METSIM中的松田胰岛素敏感性指数呈正相关(图6D-6E,扩展图6A-6F),证明DBP在人类表型中的肥胖和运动相关性。
在15个普遍下调的基因中,研究人员选择了细胞增殖和衰老调节子Cdkn1a。Cdkn1a主要在三个组织的MSCs中被训练组/抵抗肥胖组下调(图6C)。在人类中,CDKN1A与BMI、HOMA-IR、空腹胰岛素水平、CRP和WHR呈正相关,与METSIM中的松田胰岛素敏感性指数呈负相关(图6D-E,扩展图6A-6F)。CDKN1A遗传位点包含两个SNPs(单核苷酸多态性,主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种),一个内含子(rs762624)和连锁不平衡状态中的一个错义突变(rs2395655),在UK生物库中与体重、脂肪和体脂游离量以及基础代谢率显著相关。两个SNP的次要等位基因(rs762624的C和rs2395655的G)与体脂游离量增加、基础代谢率增加和HbA1c降低有保护性关联。两个SNP的次要等位基因(rs762624为C,rs2395655为G)与体脂游离量增加、基础代谢率增加和HbA1c(小编注:糖化血红蛋白(HbA1c)是红细胞中的血红蛋白与血清中的糖类(主要指葡萄糖)通过非酶反应相结合的产物,其水平可作为糖尿病的诊断检测手段。)降低显示出保护性关联。这些SNP是METSIM中CDKN1A的重要剪接量性状位点(QTLs),次要等位基因增加了非编码转录物异构体的表达(长非编码RNA)(扩展图6G-6H)。这些结果表明,CDKN1A在人类代谢表型中具有潜在的因果作用,验证了作者的结果与人类疾病的相关性。
图6|小鼠和人类的两个运动调节基因(DBP和CDKN1A)
扩展图6|DBP和CDKN1A与人类代谢性状和CDKN1剪接QTL的关联
总结
运动训练对于预防和治疗肥胖极为重要,但由于运动益处涉及多种组织和细胞类型,其潜在的机制仍然没有完全清楚。在本文中,作者通过饮食和运动训练干预解决了高脂饮食(HFD)和运动诱导的肥胖小鼠在皮下、内脏脂肪组织和骨骼肌中的单细胞挑战,并证明两种干预会带来相反的影响。研究人员在单细胞和组织水平上进行了解析,证明了MSCs(脂肪中的ASC和肌肉中的FAP)在肥胖和运动诱导中的重要作用。此外,在三种组织种,由运动和HFD调节的细胞外基质重塑和昼夜节律通路的变化是最显著的,作者推断细胞间的交流涉及以MSCs为中心的组织内和组织间对话。总的来说,作者的工作揭示了多种组织分子响应运动和肥胖的复杂性和多样性,并且发现了MSCs在运动的组织特异性和多组织有益效果中未被重视的作用,这种作用是通过其纤维生成、炎症和分化潜能的改变介导的。
原文链接:https://www.cell.com/cell-metabolism/fulltext/S1550-4131(22)00394-1
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