代谢学人

Science：限时进食，快乐减肥

撰文 | 郭文秀 高铭远 生茂正 于剑 

编辑 | 孟美瑶

校对 | 于剑

背景介绍

目前，通过饮食干预来控制体重的方法已被广泛应用。在临床上，最常用的饮食干预措施是间歇性禁食(Intermittent Fasting, IF)，交替进行禁食和进食来调节体重和代谢健康。间歇性禁食存在多种不同类型，包括隔日禁食(Alternate-day fasting, ADF)、改良禁食(Modified alternate-day fasting, MADF)和5:2饮食(5:2 diets)等。其中，限时进食(Time-Restricted Feeding, TRE)是一种大众广泛践行的热量限制方法，主要是通过将进食时间限制在固定的时间内（时间少于常规规律饮食的10-12小时），在其他时间则完全禁食。研究表明，这种进食方式可以降低体重，促进肠道微生物多样性和改善代谢健康。然而，目前人们研究方向主要集中在肠道微生物群的改善，对其本身的最佳条件和具体机制并未过多关注。

研究结果

在HFD喂养一周后，与只在活动期（暗环境）提供HFD的小鼠相比，只在非活动期（光照环境）提供HFD的小鼠体重增加较快。为了确定限时进食在非活动期期间体重增加的初始效应是否源于能量消耗的改变，作者将小鼠置于热中性(30℃)条件下（该温度被定义为小鼠在维持体温时消耗能量最少的温度）并进行监测。研究人员发现了存在与体温维持无关的促进全身代谢率的途径，这揭示了饮食诱导的产热对能量平衡的贡献（小编注：这里是引用了作者09年CM的文章，在讨论部分，作者提出：NE刺激后，小鼠脂肪组织中存在不依赖UCP1的能量消耗途径，且该途径不受饮食和外界环境温度的影响）。接下来，在一周内，对非活动期(ZT0-12)或活动期(ZT12-24)小鼠(开启光照时喂小鼠记为ZT0，关灯时喂小鼠记为ZT12)分别进行高脂饮食喂养 (图1A）。发现对照组（自由进食HFD）小鼠体重增加，这些小鼠约30%的进食时间处在光照期(图1B和图1C)。然而，与限制在活动期喂养的HFD小鼠相比，非活动期喂养的HFD小鼠的体重增加，耗氧量降低，呼吸交换比节律的改变（小编注：两组小鼠的活动量没有差异，但是呼吸交换率的波动规律存在显著不同，非活动期喂养的小鼠在ZT0-12时呼吸交换比高于其活动期组，而在活动期喂养的小鼠则在ZT12-24时交换比更高，高于其非活动期。同时，自由进食组小鼠体重最重、ZT0-12耗氧量和活动量与活动期组相似，ZT12-24时自由进食组耗氧量和活动量最高，摄食量最高，消化效率基本一致），但两者的活动量、摄食量和消化效率没有显著差异(图1B-F)。以体重为协变量的能量消耗分析[协方差分析(ANCOVA)]表明，仅在活动期进食的小鼠的总能量消耗与体重的斜率高于仅在非活动期喂养的小鼠(图1G），即在体重相同时，非活动期小鼠的能量消耗程度显著低于活动期小鼠。这一结果与活动期喂养的小鼠产热程度高于非活动期喂养小鼠的情况相一致。这些结果表明，在环境明暗循环的非活动阶段进食会导致体重增加，部分原因是能量消耗的减少。

图1 | 错误的昼夜节律喂养通过减少能量消耗促进肥胖

接下来，作者研究脂肪组织（饮食诱导的主要产热器官）代谢是否因进食时间的改变而变化。通过体内葡萄糖同位素示踪技术，作者研究了葡萄糖中的碳原子在脂肪组织糖酵解（EMP）和三羧酸(TCA)循环代谢产物中的掺入情况。作者在限时进食(Time-restricted feeding, TRF)小鼠的喂养期开始时给予口服U-13C-葡萄糖。标记的葡萄糖被iWAT和BAT迅速摄取，并在喂养后15分钟时达到峰值(图1H和图S1A）。与ZT0阶段喂养的小鼠相比，ZT12阶段喂养小鼠的iWAT和BAT中具有13C标记的丙酮酸和乳酸水平上调，这表明糖酵解过程增强，且细胞对乳酸的摄取能力可能也增强了。与ZT0期喂养的小鼠相比，ZT12喂养小鼠的iWAT中TCA循环中间体富含更多的13C。这表明摄食行为与活动期相一致会提高脂肪组织糖酵解和TCA循环对葡萄糖的利用率。

先前的研究发现，HFD小鼠WAT中的核心节律和代谢基因表达被抑制，产生异常的昼夜节律。为了探究TRF是否影响脂肪组织的节律，作者分析了iWAT和BAT中Bmal1RNA表达的峰值和低谷对应的ZT0和ZT12的基因表达 (小编注：BMAL1受到昼夜循环的调控从而处于上调或下调状态。在小鼠生物钟循环中，当ZT0点（即进入非活动期）时，BMAL1表达量最高并开始进入下一个循环，使BMAL1逐渐被抑制，直到进入活动期（ZT12）时达到低谷。具体见后文拓展阅读)，发现与自由喂养HFD以及非活动期喂养的HFD小鼠相比，活动期喂养的HFD小鼠iWAT和BAT中核心节律基因的表达出现上调(图S1B和图S1C)。此外，光照期喂养的HFD小鼠iWAT和BAT中UCP1表达降低。因此，脂肪细胞昼夜节律和产热节律的紊乱可能是在非活动时期进食产生异常代谢的原因。

每种生物都有一个重要的24小时周期机制，控制着其生理、代谢和行为，细胞内调控24小时周期节律的关键因子是转录-翻译反馈环(Transcriptional-translational feedback loops, TTFLs)，其核心由碱性-螺旋-环-螺旋(PER-ARNT-SIM, PAS)结构域蛋白BMAL1和CLOCK异二聚体组成。BMAL1和CLOCK结合在E-box位点并诱导阻抑物PER和隐花色素CRY表达，而PER和CRY又转位至细胞核反向调控异二聚体从而进一步抑制PER和CRY自身的表达，并最终引发PER和CRY蛋白降解。此时，BMAL1和CLOCK的抑制被解除，重新开始下一个节律循环。除了TTFLs翻译环，细胞中还存在涉及其他转录因子的反馈环，如孤儿核受体REV-ERB和视黄酸受体相关孤儿受体ROR。这些额外的反馈环可以对TTFLs反馈环进行调节，从而影响生物昼夜节律周期。

  BMAL1是所有生物钟基因和蛋白质中至关重要的成分，也是目前唯一已知的仅单独敲除即可导致全身昼夜节律紊乱的基因。此外，有研究表明敲除BMAL1通过抑制生物节律或引发节律紊乱，破坏生长激素和性激素的正常分泌，引发生殖系统和肝脏等器官的代谢异常，促进胰岛素抵抗、氧化应激增加以及过度的炎症反应。

参考文献：

[1]Annamneedi VP et al.Biomol Ther (Seoul) .2021 Jan 1;29(1):31-40.

[2] Bunger MK et al.Cell.2000 Dec 22;103(7):1009-17.

图S1 | 自由进食和限时进食对脂肪组织重塑和基因表达的影响

图S2 | 脂肪细胞中ZFP423的缺失增强产热作用，并与摄食时间无关

图2 | 基因通过增加糖酵解通量和改善肌酸代谢解除对脂肪细胞产热的抑制并调节错时喂养期间的代谢健康

ZFP423作为转录产热激活因子早期 B 细胞因子-2(EBF2, EBF Transcription Factor 2)活性的辅抑制因子，其可以抑制产热转录程序，这其中便包括UCP1肾上腺素能激活途径。然而，Zfp423缺失促进产热的代谢机制尚不清楚。脂肪细胞的主要产热机制包括依赖于UCP1的质子泄漏、肌酸无效循环、钙依赖的三磷酸腺苷(ATP)水解和脂质循环。为了探究Zfp423-KO小鼠脂肪细胞产热增强的代谢机制，作者对由iWAT基质血管部分分化的原代脂肪细胞进行了生物能量分析和代谢组学分析，结果发现Zfp423-KO的脂肪细胞产热基因表达、基础耗氧量和去甲肾上腺素(NE)刺激的呼吸均显著上调(图2D和图S3)，其中耗氧量的增加是由于ATP与耗氧量的解偶联。U-13C-葡萄糖同位素示踪表明，NE刺激的脂肪细胞糖酵解通量上调(图2E )，且用β3肾上腺素能受体激动剂刺激的棕色脂肪细胞也是如此。Zfp423-KO的脂肪细胞中U-13C-葡萄糖在糖酵解中间产物和最终产物中（例如丙酮酸和乳酸）的掺入量也显著上调(图2E)。Zfp423-KO脂肪细胞的糖酵解通量增强反映了其对β3肾上腺素能受体药理激活的反应（小编注：前文中作者使用同位素示踪实验，结果提示糖酵解中间产物和终产物含量上调，说明可能出现了糖酵解。另一方面，已有研究发现肾上腺素可以刺激肌糖原分解并促进糖酵解的发生）。

接下来作者使用无偏向代谢组图谱来探究脂肪细胞特异性Zfp423敲除后稳态代谢物是否存在差异。与对照组相比，在Zfp423-KO脂肪细胞中鉴定出29种差异较大的代谢物。其中，肌酸、丙酮酸和乳酸的含量增加，而磷酸肌酸和三磷酸腺苷的含量减少(图2F和图2G)。肌酸合成、输入和循环的通量上调促进了产热细胞中线粒体ATP周转的无效循环。此外，Zfp423-KO脂肪细胞的磷酸肌酸/肌酸(Pcr/Cr)比值下调，这验证了NE所产生的影响 (图2H)。此外，Zfp423-KO小鼠的iWAT中 PCr/Cr比率降低(图2H)。肌酸激酶B (CKB)是产热脂肪肌酸无效循环中主要的激酶同工酶，在HFD自由饮食期间，Zfp423-KO小鼠iWAT中肌酸激酶B (CKB)的丰度增加(图2I)。Zfp423缺失通过增加解偶联呼吸、增强NE刺激的呼吸、增加进入糖酵解的葡萄糖流量和肌酸无效循环来促进脂肪细胞的产热。因此，ZFP423调控的转录程序包含广泛的下游输出，这些下游输出控制UCP1依赖和UCP1非依赖的产热程序。

基于Zfp423-KO脂肪细胞中CKB含量的增加和肌酸无效循环情况，作者认为饮食通过肌酸代谢诱导产热可能是一个潜在的代谢机制，且在活动期限制摄食可以改善代谢健康。因此作者通过脂肪细胞特异性敲除甘氨酸氨基转移酶(GATM, Glycine amidinotransferase)(脂联素-cre; Gatmflox/flox或Gatm-KO)基因构建脂肪细胞中肌酸合成减少的小鼠（图3A）。发现与非活动期进食的WT小鼠相比，活动期进食的WT小鼠体重增加(图3B)。相比之下，脂肪细胞中GATM敲除小鼠与非活动期间进食的WT小鼠体重增加相似，并出现类似的肥胖（图3B和图3C)，且这一现象不受进食时间和饮食影响。各组之间的摄食量和活动量则无显著差异(图3D和图3E)。此外，耗氧节律(当不考虑体重差异时)显示出类似的独立于基因型的趋势(图3F)。然而，与其他组相比，在活动期喂养的WT组小鼠的总能量消耗与体重的斜率最大(图3G)。以体重为协变量进行方差分析中，脂肪特异性Gatm-KO小鼠在非活动或活动期的总能量消耗相同。这些证据表明脂肪细胞肌酸循环有助于增强活动期（黑暗期）TRF的代谢效益。

图3 | 脂肪细胞肌酸水平的遗传干扰减少TRF对活动期的代谢益处

图S3 | 脂肪细胞中ZFP423的体外缺失增强了解偶联呼吸作用，并增加了参与肌酸合成和循环的酶的表达

在BAT中，16.0%的ATACseq峰（共6829个峰)在全天不同时间均大量出现且分布广泛，最大开度出现在活动期(图4B)。在iWAT中，作者发现12.7%的峰(共3172个峰)的出现集中在整个节律周期中的两个时间段，时间段内这些基因的可及性均显著升高（即主要集中在ZT7-13和ZT19-24） (图4B)。在BAT和iWAT中，脂肪细胞染色质可及性在规范的昼夜节律基因和Ucp1中显示出夜间升高白天降低的动态开放波动。(图4C和图4 D，图S4B)。对节律峰值的归一化读数的主成分分析突出了BAT和iWAT全基因组染色质开放的周期性24小时模式 (图S4C和图S4D)。这些结果表明，组织内基因开放节律存在差异，如Ucp1、节律基因Cry1在晚上开放程度更高，而部分节律基因如CLOCK、BMAL1在白天开放程度更高。

转座酶可及染色质分析(Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high throughput sequencing, ATAC-seq)是一种利用DNA转座酶和高通量DNA测序相结合的手段来检测染色质开放性、核小体定位和转录因子分布的新型表观基因组分析方法。其中，DNA转座是指染色质中一些DNA片段（转座子）能够从染色质上一个位点转移到另一个位点从而引起基因重排的现象，这种现象通常由转座子编码的转座酶(Transposase)介导。当染色质螺旋打开，DNA结合区域裸露时，转座子被转座酶插入开放区域，引发基因序列变化。

ATAC-seq的原理是构建适用于高通量测序的转座子，而后由Tn5转座酶介导转座子整合到开放染色质区域。当染色质空间位阻较高、多核小体富集染色质或相关DNA区域被转录因子占据时，发生转座的可能性大幅降低。在这种情况下，转座子主要结合在染色质的开放位点，因此可PCR扩增的测序文库片段也优先在这些位置产生。该方法可以快速灵敏地在细胞中捕获开放染色质位点，并揭示全基因组开放染色质的基因组位置、DNA结合蛋白、单个核小体、核小体-转录因子间隔模式和具有核苷酸分辨率的调控区域的高阶致密化之间的相互作用。

参考文献：

[1] Buenrostro JD et al.Nat Methods. 2013 Dec;10(12):1213-8

[2] Adey A et al.Genome Biol. 2010;11(12):R119

图4 | 脂肪细胞的节律染色质谱揭示了BAT和iWAT中不同的可及性阶段

图S4 | 对节律性ATAC-seq峰的分析显示昼夜节律基因有很强的时间波动性

图S5 | RNA测序分析显示在BAT和iWAT中脂肪细胞和脂肪库特异性标记物富集

在2小时分辨率的时间波动峰上的基序富集分析表明，在多种转录因子所占据的区域，染色质的可及性具有强烈的节律性变化。这些因子包括过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、早期B细胞因子(EBF)、雌激素相关受体β(ESRRβ)、CCAAT增强子结合蛋白(CEBP)、糖皮质激素受体(GR)和维甲酸受体(RAR)相关孤儿受体γ(RORγ)，它们调节生物能量、脂肪形成、以及iWAT和BAT中的炎症基因网络（图4E）。此外，在肌酸代谢基因的节律可及区附近（小编注：节律可及区指肌酸代谢基因在整个节律变化中可及性较高的时间点）还发现了已知的BMAL1结合基序，例如肌酸激酶基因（Ckb），肌酸生物合成中的限速酶基因Gatm和蛋氨酸腺苷转移酶2A基因(Mat2a)，Mat2a基因表达产生用于合成肌酸的S-腺苷甲硫氨酸(SAM)(图S4E)。

为了避免温度引起小鼠代谢变化，作者通过对保持在热中性的小鼠RNA进行测序研究了染色质可及性的全基因组变化是否与脂肪细胞转录组中的时间依赖的变化相对应。作者从NuTRAP脂联素-Cre小鼠的BAT和iWAT中分离出脂肪细胞特异性翻译的RNA进行RNA测序（图5A)。在BAT和iWAT中发现了预期的脂肪细胞和特异性基因表达的富集(图S5)。在调整p<0.05的条件下，作者通过JTK_Cycle分析在BAT中鉴定了3936个随时间变化波动的振荡转录本(28.0%的基因)，并观察到大多数节律性转录本在昼夜节律周期ZT19-ZT7的单个阶段达到最大丰度，而少数基因在相反的阶段(ZT7-ZT19)达到最大表达(图5B)。KEGG途径分析表明，在ZT19-ZT7期间，与内分泌信号通路(甲状腺激素途径和胰岛素信号)、代谢通路(调节脂肪分解、鞘脂信号通路和蛋氨酸代谢)以及细胞维持通路(蛋白质分解和自噬)相关的基因富集（图5C)。在节律性RNA转录峰值的相反阶段(ZT7-ZT19)，作者确定了与TCA循环、产热、氧化磷酸化和昼夜节律相关的KEGG通路(图5C)。在iWAT中，作者通过JTK_Cycle分析鉴定了2170个振荡转录本(占比17.3%的基因)，调整p<0.05后观察到转录本振幅最大的两个时间点（ZT7和ZT23），与ATAC-seq检测到的染色质振幅最大两个时间点（ZT10和ZT21）接近 (图4B和5B)。在ZT3-ZT15期，作者确定主要参与炎症的KEGG途径，包括肿瘤坏死因子(TNF)、核因子kB(NF-κB)和Toll样受体(TLR)信号通路，白细胞跨内皮细胞迁移过程，T细胞信号通路，而在ZT15-ZT3期，可以观察到多条参与代谢的通路，包括氧化磷酸化、产热、丙酮酸和碳代谢、活性氧(ROS)和TCA循环（图5C)。

图5 | 核糖体RNA谱揭示了脂肪细胞代谢的日控制

图S6 | 脂肪组织中肌酸水平和无效肌酸循环具有节律性

图S7 | 脂肪细胞BMAL1的缺失会损害肌酸的生物合成和体内外循环

在对通过RNA-seq鉴定的节律基因和ATAC-seq时间波动峰附近基因进行重叠分析后，结果发现，BAT中有1016个共同基因，iWAT中有285个共同基因(图5D)。BAT中的几个节律性基因包括核心分子节律（分子钟基因）(Arntl, Per1, Per3, Nr1d1, Nr1d2)，参与肾上腺素能激活的因子(Adrb2，Adrb3，Creb1)，棕色脂肪细胞转录因子(Ebf1，Ebf3)，以及代谢酶(Ldha，Pcx，Pdk4)。在iWAT中，作者观察到与昼夜节律(Dbp、Ncor2、Nr1d2)、炎症(Ccl5、Irf4)以及代谢和氧化应激(Cs、Ldha、Sod1、Ucp3)相关基因的表达波动存在重叠。此外，作者在ATAC-seq和RNA-seq的节律分析之间发现了参与肌酸代谢相关基因波动的显著重叠，包括BAT中的Mat2a和iWAT中的Ckb(图5E)。总之，这些发现揭示了脂肪细胞在昼夜节律基因和肌酸代谢途径相关基因在基因组和转录水平上均受到调控，呈现出节律性。

为了分析参与肌酸代谢基因的基因组结构和转录的这些变化是否具有功能，作者在自由喂养和热中性条件下每6小时收集小鼠iWAT进行代谢组学研究，发现肌酸丰度和PCr/Cr在全天呈节律性变化，肌酸丰度的峰值和最大肌酸周期(最低PCr/Cr比值)均出现在暗周期(ZT13) (图S6A)。CKB蛋白在ZT13时含量最高(图S6B)。作者还探究了HFD条件下进行TRF限制是否影响WAT中肌酸代谢的昼夜节律性。结果表明，在活动期进食的小鼠在ZT13期间iWAT中肌酸含量达到峰值，而在非活动期进食的小鼠则缺乏肌酸。在非活动期喂养小鼠的iWAT在黑暗期没有出现PCr/Cr比值的下降，表明肌酸无效循环降低(图S6A)。在活动和非活动喂养的小鼠中，CKB蛋白的积累时间相似(图S6B)。因此，在热中性状态下（小编注：本研究小鼠体温是一个无关变量，为了排除体温对代谢的影响，因此本实验中的温度设定为热中性），脂肪组织中的肌酸含量和无效循环具有节律性

研究表明，BAT和WAT的脂肪细胞节律可能影响生物能量转录因子的激活或BMAL1节律依赖的肌酸代谢的激活。作者分析了缺乏BMAL1(Bmal1-KO)的原代脂肪细胞的基因表达和代谢物丰度。发现这些细胞中肌酸代谢基因表达降低，肌酸含量降低，PCr/Cr值增加（图S7A-C)。作者在脂肪细胞特异性Bmal1-KO小鼠的iWAT中观察到了类似的结果(图S7D-G)。另外，脂肪细胞特异性Bmal1-KO小鼠iWAT中SAM、MAT2A和CKB显著降低(图S7F-H)。从胍乙酸合成肌酸的途径消耗了超过40%的甲基。因此，缺乏BMAL1的脂肪细胞中肌酸丰度降低的部分原因可能是由于SAM合成受限。

为了确定BMAL1能否在基因组水平上直接调节肌酸酶，作者对WAT中的BMAL1进行了染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)。结果显示，在WAT中没有观察到Gatm或Ckb的BMAL1基因组结合位点。因此，BMAL1可能通过其他生物节律基因对这些酶进行间接调控。然而，在Mat2a的启动子上发现了一个BMAL1结合位点(图S7I)。考虑到缺乏Bmal1的脂肪细胞中Mat2a的表达较低，可以推测Mat2a和SAM的下降会导致Bmal1-KO脂肪细胞肌酸合成减少。这些基因组和代谢组学结果表明，脂肪细胞的分子节律产生肌酸合成和代谢的节律周期与环境的明暗周期相一致。

为了探究肌酸代谢中节律控制是否是TRF期产热作用增强的基础，作者使用了脂肪细胞中BMAL1特异性敲除的小鼠(Bmal1-KO小鼠)。与对照组相比，这些小鼠在非活动期消耗更多的食物，在室温下自由进食HFD时体重增加更多。作者在热中性条件下喂养Bmal1-KO小鼠，并在非活动或非活动时期均匀喂养HFD与预期一致，在非活动期喂养HFD的WT小鼠比在活动期喂养HFD的WT小鼠增重更多(图S8A)。在非活动期喂养HFD的Bmal1-KO小鼠、在活动期喂养HFD的Bmal1-KO小鼠、在非活动期喂养HFD的WT小鼠三组小鼠体重增加相等，并具有相似的葡萄糖耐量（图S8A-C)。

图6 | 脂肪细胞节律通过肌酸代谢调节代谢健康

图S8 | 脂肪细胞中的分子节律是在限时进食期间代谢益处所必需的

图S9 | 脂肪细胞中BMAL1过表达增强了iWAT中昼夜节律基因的表达，而不影响食物摄入或活动