为了探究酮体诱导MuSC DQ（KIDQ）的潜在分子机制，研究人员从补充外源性酮体的小鼠中分离MuSC进行转录组测序以及GO分析，发现酮体导致MuSC中细胞周期相关基因发生显著下调，包括增殖相关基因如E2F家族成员，CDK2和细胞周期蛋白家族成员等；此外，研究人员还观察到参与抑制细胞增殖和生长的相关基因显著上调，包括CDKN1A（p21）和CDKN2D（p19）（Figure 3A-C）。并且，研究人员发现在注射酮体的小鼠MuSC中发现p21与cyclin D1（cyclin D1促进细胞增殖）（小编注：有文献表明p21转录水平升高以及cyclin D1转录水平降低，会将细胞抑制在G1/S期，从而抑制细胞增殖）的mRNA比例显著增加，说明酮体抑制小鼠MuSC增殖（Figure S3A）。同时，衰老标记物p16表达水平没有发生显著变化（Figure S3B）。

给小鼠注射外源性酮体后，MuSC中除了细胞周期相关基因转录表达发生显著变化外，研究人员还发现肌生成相关基因如MYF5和MYOD1表达显著降低，而MuSC干性标记物CD34则显著上调（Figure 3D and S3C）。先前的研究表明，MuSC主要通过抑制MYOD1翻译维持其静息状态，即静息态MuSC中具有较高的Myod1 mRNA水平，但其翻译过程被抑制，MYOD1蛋白水平较低，从而维持MuSC的静息状态，但同时MuSC也能快速解除翻译抑制，为激活时的分化增殖与肌生成做准备。而DQ状态下的MuSC中MYOD1转录下调且CD34转录上调，这表明处于DQ状态的MuSC具有较高的干性和较低的肌生成活性。先前的研究表明Pax7启动子活性与细胞静息状态正相关，研究人员也发现DQ状态下的MuSC中Pax7总转录水平没有发生明显变化，但具有Pax7hi启动子活性的MuSC数量显著升高（小编注：本文通过对补充外源性酮体的小鼠中分离MuSC进行转录组测序，发现与WT相比，酮体处理的MuSC中Pax7转录水平没有发生变化；但是利用流式分析来源于补充外源性酮体或对照Pax7-ZsGreen鼠(在绿色荧光蛋白前加上了Pax7启动子)的MuSC，发现补充外源性酮体后Pax7启动子活性较强的细胞亚群增多。可能测序数据精度不一定能检测到Pax7转录水平差异，并且转录水平也不止受启动子活性调控，可能还有其他因素如mRNA稳定性等多种因素参与。所以作者利用流式的方式证明酮体处理后MuSC Pax7启动子活性增加），且在培养过程中，DQ状态下MuSC的Pax7启动子活性持续时间更长（Figure 3E-3F, Figure S3D-SS3E）。

先前研究表明Pax7hi细胞比Pax7lo细胞具有更强的移植能力，因此为了探究DQ状态下MuSC的移植潜力，研究人员将携带不同标记的DQ状态MuSC和对照MuSC移植到同一受损肌肉中，28天后分离移植的MuSC，发现DQ 态MuSC细胞数量显著多于对照MuSC数量（Figure S3F），表明DQ态MuSC具有较强的移植潜力。

Fig. 3 MuSC DQ抑制细胞增殖和肌生成

Figure S3. 酮体诱导促进MuSC表现DQ转录特征

4.KIDQ可提高MuSC抗逆性

为了探究 DQ 状态MuSC在体外培养时由静息态转变为激活态的活化情况，研究人员体外培养来自酮症小鼠和对照小鼠的MuSC，培养48h后发现培养基中来自酮症小鼠的MuSC数量显著多于对照MuSC（Figure S3G）。由于DQ态的MuSC需要花费更长的时间退出静息状态进入细胞周期，因此研究人员推测酮症小鼠MuSC数量增加可能并不是由于增殖速度变快，而是因为在体外激活过程的压力下细胞生存能力更强。与这一假设一致的是，研究人员发现DQ 态MuSC在体外培养时细胞死亡率显著减少，这表明在DQ状态下MuSC的抗逆性显著增加（Figure S3H–S3J）。接下来，为了探究DQ状态的MuSC对其他形式的应激是否同样具有抵抗能力，研究人员对体外培养的MuSC进行氧化应激和急性营养饥饿处理，发现DQ状态MuSC的死亡率显著低于对照MuSC，表明DQ 状态的MuSC在应对不同形式的应激时也具有较强的抵抗力（Figure 4A and S3K）。总之，这些结果表明了增强的适应力和抗逆性是DQ状态MuSC的另一个关键特征。

先前有研究发现衰老MuSC在静息状态向激活状态转变时存活率显著下降，而由于DQ状态MuSC在体外培养过程时细胞死亡率明显降低，那么利用酮体诱导衰老MuSC进入DQ状态是否也可以提高衰老MuSC存活率？因此研究人员对24月龄的衰老小鼠腹腔注射酮体1周，随后分离出后肢MuSC进行体外培养，并在48h后检测MuSC细胞死亡率，发现酮体诱导的DQ状态显著提高了衰老MuSC的存活率（Figure 4B）。

接下来，为了探究酮体是否是直接作用于MuSC来诱导MuSC DQ，研究人员用BHB（禁食期间产生的主要酮体）处理体外培养的MuSC，发现MuSC的存活率的显著提高，并且降低了MuSC进入S期的速率，且这一效果具有剂量依赖性（Figure 4C），这与酮症小鼠MuSC DQ的表型一致。同样，用BHB处理体外培养的人原代MuSC，也可以提高MuSC的存活率并抑制MuSC进入S期（Figure S3L and S3M）。同时，研究人员在体内进行了干细胞移植实验，将RFP标记的MuSC在含有BHB的培养基中培养60h诱导MuSC进入DQ状态，随后将DQ态的MuSC移植到小鼠的受损肌肉中，14天后检测小鼠肌肉中RFP阳性的肌纤维比例，发现与对照MuSC相比，来源于DQ态MuSC的新生肌纤维比例较高（Figure 4D）。由于酮症小鼠MuSC的转录组分析发现DQ态MuSC中与细胞增殖和肌生成相关基因表达呈显著下调趋势（Figure 3B-3D and S3C），因此来源于DQ态MuSC的新生肌纤维较多可能是由于DQ态提高了MuSC在移植后的存活率而不是增殖能力。为了在体内验证BHB诱导DQ态MuSC的抗逆性是否增强，研究人员将腹腔注射BHB的小鼠后肢暴露于X射线照射1周，随后从后肢肌肉中分离出MuSC进行体外培养48h，检测MuSC存活率，发现与没有BHB处理的小鼠相比，注射BHB的小鼠MuSC存活率显著升高（Figure 4E）。总之，BHB诱导DQ态的MuSC具有较高的抗逆性。

Fig. 4 KIDQ可促进MuSC抗逆性

5.酮体通过HDAC1-p53轴促进MuSCs进入深度静息态

那么，酮体是通过何种机制诱导MuSC进入DQ状态的呢？先前研究发现静息状态下的细胞具有独特的代谢特征，因此研究人员推测酮体可能通过改变MuSC中代谢稳态诱导其DQ状态。研究人员对DQ态MuSC和激活态MuSC进行非靶向shotgun蛋白质组学分析（shotgun蛋白质组学的目的是分析鉴定样品中尽可能多的蛋白质，其独特之处在于：结合高效液相色谱技术和质谱技术，在最小限度分离蛋白质的同时，对多种蛋白质进行鉴定和定量），发现OXCT1（催化酮体分解为乙酰辅酶A过程中的限速酶）在静息状态下表达显著升高（Figure 5A and S4A），这表明酮体可能通过转化为乙酰辅酶A促进MuSC进入DQ状态。为了进一步验证这一结论，研究人员构建OXCT1 KO小鼠（MuSC特异性敲除OXCT1的ERT小鼠），并通过腹腔注射三苯氧胺诱导OXCT1基因的敲除（Figure S4B and S4C），随后每天给OXCT1 KO小鼠注射3次酮体，持续注射7天，发现在外源性酮体处理下，OXCT1 KO小鼠和WT小鼠的MuSC表型并没有显著差异（Figure 5B and S4D-S4F），这些结果提示在MuSC中，酮体可能并非通过直接的代谢调控诱导DQ。

有研究表明AcAc和BHB都具有非代谢性调控功能，因此研究人员进一步探究了哪一种代谢物是酮体诱导MuSC进入DQ状态的主要驱动因子。由于BHB有2种构象：R-BHB和S-BHB，R-BHB可在BDH1（β-羟丁酸脱氢酶）催化下与AcAc进行相互转换，而S-BHB无法转化为AcAc，因此研究人员分别利用R-BHB和S-BHB来处理MuSC，发现仅S-BHB处理足以诱导MuSC的DQ表型，并显著提高了MuSC的存活率（Figure 5C-D）。这些结果证明了BHB本身足以诱导MuSC进入DQ状态，且这一过程与BHB向AcAc的转换无关。

BHB作为HDACs（组蛋白去乙酰酶）的内源性抑制剂发挥非代谢功能已被广泛报道。因此为了探究BHB是否影响了MuSC中的组蛋白乙酰化修饰，研究人员用BHB处理体外培养的MuSC，并检测H3K9（HDAC经典的修饰靶点）乙酰化修饰，发现在BHB处理下H3K9乙酰化修饰显著升高；同样，禁食诱导的酮症也促进了小鼠MuSC中H3K9和H3K14乙酰化水平升高，说明BHB在MuSC中可能发挥了HDAC抑制剂的作用（Figure 5E, Figure S4G and S4H）。假设BHB确实通过抑制HDAC来诱导MuSC DQ，那么抑制HDAC也同样可以诱导MuSC DQ，因此为了证明这一假设，研究人员给小鼠腹腔注射Givinostat（HDAC抑制剂）一周，发现注射Givinostat的小鼠MuSC表现出与酮症小鼠MuSC一致的DQ特征，且小鼠体重和血液中酮体水平并没有显著差异（Figure 5F-G，S5A-S5D）。此外，从小鼠后肢肌肉中分离MuSC进行体外培养，发现来自Givinostat处理的小鼠MuSC存活率更高，并且应对急性营养饥饿应激时表现出更高的抵抗力（Figure 5H，S5E and S5F）。值得注意的是，Givinostat注射对小鼠MuSC的影响在停止注射3天后仍然存在，这与由禁食诱导的MuSC DQ特征一致（Figure S5G-S5J）。为了验证Givinostat是否直接作用于MuSC来诱导MuSC DQ，研究人员用Givinostat处理体外培养的MuSC 48h，发现Givinostat处理显著提高了MuSC的存活率并抑制MuSC进入S期，与BHB体外处理MuSC的结果一致（Figure 5I）。总之，这些结果表明抑制HDAC促进MuSC中组蛋白乙酰化修饰水平，可诱导MuSC DQ。

为了探究哪类HDAC参与诱导MuSC DQ，研究人员利用HDACs抑制剂化学文库进行筛选，发现在能够诱导MuSC DQ的抑制剂中，HDAC1抑制剂高度富集（小编注：研究人员用HDAC1和HDAC2抑制剂处理体外培养的MuSC，发现有2个HDAC2抑制剂可以诱导MuSC DQ，随后研究人员用这2个HDAC2抑制剂（Drox和MC）注射小鼠进行体内验证，发现MuSC并没有表现DQ特征，说明只有HDAC1抑制剂可以诱导MuSC DQ）（Figure S6A–S6D）。为了在体内验证这一结论，研究人员向小鼠腹腔注射了不同的HDACs抑制剂，发现只有HDAC 1抑制剂能够诱导MuSCs DQ（Figure S6E and S6F）。总之，这些结果进一步表明抑制HDAC1可诱导MuSC DQ。

接下来，为了探究在诱导MuSC DQ中起作用的HDAC1的下游调控因子，研究人员检测了BHB处理后MuSC中的蛋白泛乙酰化水平，发现在BHB处理后53kD、17kD、15kD处泛乙酰化修饰水平显著升高（小编注：研究人员检测了MuSC中所有蛋白的泛乙酰化修饰发现53kD、17kD、15kD位置的蛋白泛乙酰化修饰水平升高。由于p53蛋白是HDAC1的经典靶蛋白，且研究人员在先前工作中发现在正常肌肉再生过程中，p53活性被激活。因此研究人员猜测可能p53在BHB处理后乙酰化水平升高，随后用p53乙酰化的抗体进行了验证）（Figure 6A）。由于p53蛋白大小约53kD，是经典的HDAC1靶蛋白，于是研究人员将目光聚焦于p53蛋白。已有研究表明p53可以在不同的位点上发生乙酰化修饰，包括K379，且K379位点乙酰化修饰已被证明可以促进p53的DNA结合活性，诱导癌细胞凋亡并促进某些非癌细胞的存活率，于是研究人员利用p53 K379乙酰化抗体检测发现，禁食、生酮饮食和外源性酮体处理显著提高了MuSC中p53的乙酰化修饰（Figure 6B-6D and S7A），此外通过基因富集分析发现DQ态MuSC中与p53通路相关基因显著富集（Figure 6E），研究人员在先前的研究中也证实了p53活性可提高MuSC存活率（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30244867/）。总之，这些结果表明抑制HDAC1可能通过促进p53乙酰化修饰水平和活性，诱导MuSC DQ。

接下来，为了探究p53在KIDQ中的潜在作用，研究人员构建了p53 KO小鼠（MuSC特异性敲除p53基因的ERT小鼠，即Pax7 CreERT），给小鼠腹腔注射三苯氧胺诱导p53基因特异性敲除，随后饥饿p53 KO小鼠2.5天，发现与WT小鼠相比，p53 KO小鼠MuSC的DQ表型被部分抑制（Figure S7B-S7F）。为了验证p53是否介导BHB对MuSC的直接作用，研究人员分离p53 KO小鼠和WT小鼠MuSC并体外培养，随后用BHB处理体外培养的MuSC 48h，发现敲除p53后，BHB处理不再影响MuSC的细胞存活率和进入S期的速率（Figure 6F and 6G）。这些结果表明p53在酮体诱导MuSC DQ过程中起着重要作用。

为了探究p53活性是否可以诱导MuSC DQ，研究人员给小鼠腹腔注射nutlin-3（p53激活剂），发现nutlin-3激活体内p53活性可再现MuSC的DQ特征（Figure 6H-6J and S7G-S7H），此外，nutlin-3体外处理MuSC 48h也显著提高了MuSC的存活率并抑制MuSC进入S期（Figure S7I and S7J）。研究表明p53活性可以通过其C端赖氨酸乙酰化修饰来调节，例如K379位点（人类K382位点）乙酰化修饰，而将p53蛋白C端多个赖氨酸（K）位点突变为谷氨酰胺（Q）可以模拟高度乙酰化修饰的p53蛋白（p53^KQ）。为了证实p53蛋白高度乙酰化修饰是否可以模拟酮体的作用，研究人员构建了p53^KQ小鼠，检测p53^KQ小鼠MuSC是否表现出DQ特征，发现p53^KQ小鼠MuSC中p53活性升高并表现出DQ特征，如细胞体积减小，线粒体数量减少，细胞存活率升高以及抑制MuSC进入S期（Figure 7A-7E）。总之，这些结果表明p53活性可诱导MuSC DQ。

Fig. 5 酮体以非代谢活性抑制HDAC诱导DQ

Fig. 6 p53是诱导MuSC DQ的充分必要因素

Fig. 7 p53蛋白乙酰化可诱导MuSC DQ

Figure S4. 酮体以非代谢途径诱导MuSC DQ

Figure S5. HDAC药理抑制剂处理可再现酮体和禁食诱导的MuSC DQ表型

Figure S6.  HDAC1抑制剂处理可再现酮体和禁食诱导的MuSC DQ表型

Figure S7. p53是诱导MuSC DQ的充分必要因素

总结

本篇文章发现了短期禁食、生酮饮食或外源性酮体处理可通过BHB的代谢非依赖性调控功能抑制MuSC中HDAC1活性，诱导p53蛋白乙酰化修饰，促进p53蛋白活性，进而诱导MuSC进入深度静息状态。此时MuSC中肌生成相关基因转录表达下调，肌肉损伤后的修复能力下降，但MuSC应对外界胁迫时的抵抗力增强，存活力显著提高。总之，本项研究揭示了禁食或酮症会激活MuSC中的保护性程序，以提高MuSC面对胁迫时的抗逆性。

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