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代谢学人--Cell Metabolism: 禁食让干细胞变身“睡美人”

已有 3528 次阅读 2022-6-10 13:33 |个人分类:代谢精读|系统分类:科研笔记

代谢学人

Cell Metabolism: 禁食让干细胞变身“睡美人”

撰文 | 郑宇含 王佳雯 张婷 李雨

编辑 | 孟美瑶

校对 | 张彦康

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背景介绍

      近年来越来越多的研究表明短期禁食是一种有益健康的饮食模式。在多种小鼠模型中发现禁食不仅可以缓解肥胖,降低癌症发生率,增强免疫系统功能,还可以缓解衰老小鼠的认知功能衰退;且临床试验也证实禁食可减少糖尿病、心血管疾病和癌症的发生率。此外,禁食也可在一定程度上增加细胞的抗逆能力,保护正常细胞和器官免受环境压力或有毒物质的影响。例如短期饥饿的酿酒酵母或者原代神经胶质细胞可以更好的抵抗氧化应激。在小鼠中,短期饥饿也同样可保护小鼠的正常细胞免受ROS类化疗药物的影响。此外,禁食还可以改善干细胞的衰老表型,例如,衰老在肌肉干细胞中导致其marker PAX7表达下调,而短期卡路里限制饮食可以使其恢复到年轻水平。


       MuSC(肌肉干细胞)对损伤肌肉的再生和肌肉功能的维持至关重要。在正常生理状态下,MuSC受周围微环境信号和细胞周期检查点的共同调节而处于静息状态。在肌肉受损时,MuSC则会激活并进入细胞周期开始增殖补充肌肉中MuSC数量,或分化形成肌纤维以修复受损肌肉。肌肉中,Notch信号通路对于维持MuSC静息态至关重要,在MuSC中敲除RBP-J(Notch信号通路中关键的DNA结合因子)抑制了Notch信号通路,促使MuSC从静息态转为激活态;此外,Notch信号可通过上调CDK抑制因子的表达驱动MuSC维持静息状态。处于静息状态的MuSC代谢活性较低且能抵抗环境压力。虽然禁食可以促进肌肉干细胞功能,但禁食对MuSC静息态的维持以及肌肉受损修复的作用机制目前尚不清楚。
      近期Cell Metabolism杂志发表一篇研究文章“Fasting induces a highly resilient deep quiescent state in muscle stem cells via ketone body signaling”,发现了禁食、生酮饮食或外源性酮体可通过抑制HDAC1活性,诱导p53蛋白乙酰化并促进p53活性,进而诱导MuSC进入DQ(深度静息)状态,在抑制肌生成活性的同时增强了MuSC对环境胁迫的抗逆性。本文研究揭示了酮体通过诱导MuSC DQ而影响肌肉再生和应激响应的新机制。

敲黑板啦!

1、 禁食诱导MuSC高抗逆性的深度静息状态(DQ)
2、  DQ的特点是抑制细胞周期,但细胞抗逆性增强。
3、  BHB(β-羟丁酸)直接诱导MuSC DQ。
4、  BHB的作用是抑制HDAC并激活p53活性。

研究结果

1.禁食可抑制肌肉再生,且重新喂食后这一现象仍会持续

       为了深入了解禁食对肌肉再生修复的影响,研究人员在禁食小鼠0、1、2和2.5天后,原位注射氯化钡(BaCl2)损伤小鼠胫骨前肌(TA),并在给食状态下恢复7天(Figure 1A),通过测量新生肌纤维的横截面积,发现肌肉修复能力随着损伤前禁食时间的延长而降低(Figure 1B and 1C)。为了探索禁食对肌肉修复能力的抑制是否具有可逆性,研究人员在禁食小鼠2.5天后再分别重新喂食1、2、3和7天,随后损伤小鼠TA,并在给食状态下恢复7天后,检测小鼠TA修复程度(Figure 1D),发现在重新喂食3天后,尽管体重已恢复到正常水平,但肌肉再生仍然受到抑制,在重新喂食7天后,禁食对肌肉再生的抑制效应才得以消除(Figure 1E-1G)。这些发现表明,禁食会抑制肌肉再生,并且在重新喂食后这种抑制状态仍会持续一段时间

拓展阅读

BaCl2诱导肌肉损伤小鼠模型原理

BaCl2诱导的肌肉损伤被广泛用于肌纤维损伤和肌肉再生的研究。由于Ba2+具有阻断K+的能力,因此肌肉定点注射BaCl2后,肌纤维会发生去极化(肌纤维中含有KV, KIR, KCa,和KATP通道),促进了Ca2+释放,Ca2+浓度的升高会激活中性蛋白酶介导的蛋白水解,导致肌纤维降解。此外,Ba2+可以进入线粒体,通过产生过氧化物,消耗线粒体膜电位,线粒体的破坏使细胞色素C从线粒体释放到胞质中,启动细胞凋亡程序,从而造成肌肉损伤。

参考文献:

1. Aaron B Morton, et al. Skelet Muscle. 2019

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Fig. 1 禁食可抑制肌肉再生,且再喂食后仍会持续

2.禁食通过酮体促进肌肉干细胞进入深度静息状态  

研究表明,MuSC(肌肉干细胞)对受损后肌肉再生过程至关重要,因此为了研究短期禁食对MuSC功能的影响,研究人员通过流式分选技术从禁食2.5天小鼠的后肢中分离出MuSC,发现与自由喂食小鼠相比,禁食小鼠MuSC细胞体积显著减小(Figure 2A)。此外,禁食小鼠MuSC的线粒体数量、总RNA含量和耗氧量均显著减少(Figure 2B, S1A and S1B),且MuSC进入S期的时间也显著延迟(Figure 2C and S1C),这提示来自禁食小鼠的MuSC表现出DQ状态特有的特征。此外,研究人员还发现尽管禁食小鼠的体重在再喂食后会逐渐恢复到原来水平,但MuSC的DQ状态在再喂食后仍会持续2天(Figure 1G, Figure S1D–S1F)。这些数据表明在禁食诱导下,MuSC处于DQ状态,并且在重新喂食后这种状态也会持续数天,这也对研究人员在禁食小鼠甚至是在禁食后再喂食3天的小鼠中观察到的肌肉再生能力下降现象做出了解释。

拓展阅读


MuSC分离方法

先前研究发现小鼠肌肉MuSC只存在于VCAM1+/CD31-/CD45-/Sca1-细胞亚群中。因此,研究人员首先用Ⅱ型胶原酶和Dispase分散酶研磨并消化TA,随后经35mm过滤器过滤,并利用流式细胞仪(FACS)分选VCAM1阳性和CD45、CD31和Sca1阴性的细胞,在体外生长培养基中培养,进行下一步实验。

参考文献:

1. Ling Liu, et al. Nat Protoc. 2015


细胞的DQ特征

静息是一种细胞非增殖状态,常被称为G0状态,静息状态不是一种均匀的状态,随着时间推移,细胞逐渐向深度静息(DQ)状态转变,对生长信号的敏感度越来越低。处于DQ状态的细胞进入S期的速率显著降低,DNA复制过程被抑制,细胞总RNA含量,以及线粒体数量显著减少。并且,细胞退出DQ状态进入细胞周期所需的生长因子浓度更高,以及所需刺激时间更长。

参考文献:

1. Kotaro Fujimaki, et al. PNAS. 2019

2. Jungeun Sarah Kwon, et al.  Cell Rep. 2017

 Fig. 2 禁食通过酮体促进MuSC进入深度静息状态

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Figure S1. 禁食诱导MuSC DQ,这一现象在重新喂食后被抑制

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Figure S2. 生酮饮食或补充外源性酮体可促进MuSC DQ

3.MuSC DQ抑制细胞增殖和肌生成

为了探究酮体诱导MuSC DQ(KIDQ)的潜在分子机制,研究人员从补充外源性酮体的小鼠中分离MuSC进行转录组测序以及GO分析,发现酮体导致MuSC中细胞周期相关基因发生显著下调,包括增殖相关基因如E2F家族成员,CDK2和细胞周期蛋白家族成员等;此外,研究人员还观察到参与抑制细胞增殖和生长的相关基因显著上调,包括CDKN1A(p21)和CDKN2D(p19)(Figure 3A-C)。并且,研究人员发现在注射酮体的小鼠MuSC中发现p21与cyclin D1(cyclin D1促进细胞增殖)(小编注:有文献表明p21转录水平升高以及cyclin D1转录水平降低,会将细胞抑制在G1/S期,从而抑制细胞增殖)的mRNA比例显著增加,说明酮体抑制小鼠MuSC增殖(Figure S3A)。同时,衰老标记物p16表达水平没有发生显著变化(Figure S3B)。

给小鼠注射外源性酮体后,MuSC中除了细胞周期相关基因转录表达发生显著变化外,研究人员还发现肌生成相关基因如MYF5和MYOD1表达显著降低,而MuSC干性标记物CD34则显著上调(Figure 3D and S3C)。先前的研究表明,MuSC主要通过抑制MYOD1翻译维持其静息状态,即静息态MuSC中具有较高的Myod1 mRNA水平,但其翻译过程被抑制,MYOD1蛋白水平较低,从而维持MuSC的静息状态,但同时MuSC也能快速解除翻译抑制,为激活时的分化增殖与肌生成做准备。而DQ状态下的MuSC中MYOD1转录下调且CD34转录上调,这表明处于DQ状态的MuSC具有较高的干性和较低的肌生成活性。先前的研究表明Pax7启动子活性与细胞静息状态正相关,研究人员也发现DQ状态下的MuSC中Pax7总转录水平没有发生明显变化,但具有Pax7hi启动子活性的MuSC数量显著升高(小编注:本文通过对补充外源性酮体的小鼠中分离MuSC进行转录组测序,发现与WT相比,酮体处理的MuSC中Pax7转录水平没有发生变化;但是利用流式分析来源于补充外源性酮体或对照Pax7-ZsGreen鼠(在绿色荧光蛋白前加上了Pax7启动子)的MuSC,发现补充外源性酮体后Pax7启动子活性较强的细胞亚群增多。可能测序数据精度不一定能检测到Pax7转录水平差异,并且转录水平也不止受启动子活性调控,可能还有其他因素如mRNA稳定性等多种因素参与。所以作者利用流式的方式证明酮体处理后MuSC Pax7启动子活性增加),且在培养过程中,DQ状态下MuSC的Pax7启动子活性持续时间更长(Figure 3E-3F, Figure S3D-SS3E)。

先前研究表明Pax7hi细胞比Pax7lo细胞具有更强的移植能力,因此为了探究DQ状态下MuSC的移植潜力,研究人员将携带不同标记的DQ状态MuSC和对照MuSC移植到同一受损肌肉中,28天后分离移植的MuSC,发现DQ 态MuSC细胞数量显著多于对照MuSC数量(Figure S3F),表明DQ态MuSC具有较强的移植潜力

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Fig. 3 MuSC DQ抑制细胞增殖和肌生成

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Figure S3. 酮体诱导促进MuSC表现DQ转录特征

4.KIDQ可提高MuSC抗逆性

为了探究 DQ 状态MuSC在体外培养时由静息态转变为激活态的活化情况,研究人员体外培养来自酮症小鼠和对照小鼠的MuSC,培养48h后发现培养基中来自酮症小鼠的MuSC数量显著多于对照MuSC(Figure S3G)。由于DQ态的MuSC需要花费更长的时间退出静息状态进入细胞周期,因此研究人员推测酮症小鼠MuSC数量增加可能并不是由于增殖速度变快,而是因为在体外激活过程的压力下细胞生存能力更强。与这一假设一致的是,研究人员发现DQ 态MuSC在体外培养时细胞死亡率显著减少,这表明在DQ状态下MuSC的抗逆性显著增加(Figure S3H–S3J)。接下来,为了探究DQ状态的MuSC对其他形式的应激是否同样具有抵抗能力,研究人员对体外培养的MuSC进行氧化应激和急性营养饥饿处理,发现DQ状态MuSC的死亡率显著低于对照MuSC,表明DQ 状态的MuSC在应对不同形式的应激时也具有较强的抵抗力(Figure 4A and S3K)。总之,这些结果表明了增强的适应力和抗逆性是DQ状态MuSC的另一个关键特征。

先前有研究发现衰老MuSC在静息状态向激活状态转变时存活率显著下降,而由于DQ状态MuSC在体外培养过程时细胞死亡率明显降低,那么利用酮体诱导衰老MuSC进入DQ状态是否也可以提高衰老MuSC存活率?因此研究人员对24月龄的衰老小鼠腹腔注射酮体1周,随后分离出后肢MuSC进行体外培养,并在48h后检测MuSC细胞死亡率,发现酮体诱导的DQ状态显著提高了衰老MuSC的存活率(Figure 4B)。

接下来,为了探究酮体是否是直接作用于MuSC来诱导MuSC DQ,研究人员用BHB(禁食期间产生的主要酮体)处理体外培养的MuSC,发现MuSC的存活率的显著提高,并且降低了MuSC进入S期的速率,且这一效果具有剂量依赖性(Figure 4C),这与酮症小鼠MuSC DQ的表型一致。同样,用BHB处理体外培养的人原代MuSC,也可以提高MuSC的存活率并抑制MuSC进入S期(Figure S3L and S3M)。同时,研究人员在体内进行了干细胞移植实验,将RFP标记的MuSC在含有BHB的培养基中培养60h诱导MuSC进入DQ状态,随后将DQ态的MuSC移植到小鼠的受损肌肉中,14天后检测小鼠肌肉中RFP阳性的肌纤维比例,发现与对照MuSC相比,来源于DQ态MuSC的新生肌纤维比例较高(Figure 4D)。由于酮症小鼠MuSC的转录组分析发现DQ态MuSC中与细胞增殖和肌生成相关基因表达呈显著下调趋势(Figure 3B-3D and S3C),因此来源于DQ态MuSC的新生肌纤维较多可能是由于DQ态提高了MuSC在移植后的存活率而不是增殖能力。为了在体内验证BHB诱导DQ态MuSC的抗逆性是否增强,研究人员将腹腔注射BHB的小鼠后肢暴露于X射线照射1周,随后从后肢肌肉中分离出MuSC进行体外培养48h,检测MuSC存活率,发现与没有BHB处理的小鼠相比,注射BHB的小鼠MuSC存活率显著升高(Figure 4E)。总之,BHB诱导DQ态的MuSC具有较高的抗逆性。

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Fig. 4 KIDQ可促进MuSC抗逆性

5.酮体通过HDAC1-p53轴促进MuSCs进入深度静息态

那么,酮体是通过何种机制诱导MuSC进入DQ状态的呢?先前研究发现静息状态下的细胞具有独特的代谢特征,因此研究人员推测酮体可能通过改变MuSC中代谢稳态诱导其DQ状态。研究人员对DQ态MuSC和激活态MuSC进行非靶向shotgun蛋白质组学分析(shotgun蛋白质组学的目的是分析鉴定样品中尽可能多的蛋白质,其独特之处在于:结合高效液相色谱技术和质谱技术,在最小限度分离蛋白质的同时,对多种蛋白质进行鉴定和定量),发现OXCT1(催化酮体分解为乙酰辅酶A过程中的限速酶)在静息状态下表达显著升高(Figure 5A and S4A),这表明酮体可能通过转化为乙酰辅酶A促进MuSC进入DQ状态。为了进一步验证这一结论,研究人员构建OXCT1 KO小鼠(MuSC特异性敲除OXCT1的ERT小鼠),并通过腹腔注射三苯氧胺诱导OXCT1基因的敲除(Figure S4B and S4C),随后每天给OXCT1 KO小鼠注射3次酮体,持续注射7天,发现在外源性酮体处理下,OXCT1 KO小鼠和WT小鼠的MuSC表型并没有显著差异(Figure 5B and S4D-S4F),这些结果提示在MuSC中,酮体可能并非通过直接的代谢调控诱导DQ

有研究表明AcAc和BHB都具有非代谢性调控功能,因此研究人员进一步探究了哪一种代谢物是酮体诱导MuSC进入DQ状态的主要驱动因子。由于BHB有2种构象:R-BHB和S-BHB,R-BHB可在BDH1(β-羟丁酸脱氢酶)催化下与AcAc进行相互转换,而S-BHB无法转化为AcAc,因此研究人员分别利用R-BHB和S-BHB来处理MuSC,发现仅S-BHB处理足以诱导MuSC的DQ表型,并显著提高了MuSC的存活率(Figure 5C-D)。这些结果证明了BHB本身足以诱导MuSC进入DQ状态,且这一过程与BHB向AcAc的转换无关。

BHB作为HDACs(组蛋白去乙酰酶)的内源性抑制剂发挥非代谢功能已被广泛报道。因此为了探究BHB是否影响了MuSC中的组蛋白乙酰化修饰,研究人员用BHB处理体外培养的MuSC,并检测H3K9(HDAC经典的修饰靶点)乙酰化修饰,发现在BHB处理下H3K9乙酰化修饰显著升高;同样,禁食诱导的酮症也促进了小鼠MuSC中H3K9和H3K14乙酰化水平升高,说明BHB在MuSC中可能发挥了HDAC抑制剂的作用(Figure 5E, Figure S4G and S4H)。假设BHB确实通过抑制HDAC来诱导MuSC DQ,那么抑制HDAC也同样可以诱导MuSC DQ,因此为了证明这一假设,研究人员给小鼠腹腔注射Givinostat(HDAC抑制剂)一周,发现注射Givinostat的小鼠MuSC表现出与酮症小鼠MuSC一致的DQ特征,且小鼠体重和血液中酮体水平并没有显著差异(Figure 5F-G,S5A-S5D)。此外,从小鼠后肢肌肉中分离MuSC进行体外培养,发现来自Givinostat处理的小鼠MuSC存活率更高,并且应对急性营养饥饿应激时表现出更高的抵抗力(Figure 5H,S5E and S5F)。值得注意的是,Givinostat注射对小鼠MuSC的影响在停止注射3天后仍然存在,这与由禁食诱导的MuSC DQ特征一致(Figure S5G-S5J)。为了验证Givinostat是否直接作用于MuSC来诱导MuSC DQ,研究人员用Givinostat处理体外培养的MuSC 48h,发现Givinostat处理显著提高了MuSC的存活率并抑制MuSC进入S期,与BHB体外处理MuSC的结果一致(Figure 5I)。总之,这些结果表明抑制HDAC促进MuSC中组蛋白乙酰化修饰水平,可诱导MuSC DQ。

为了探究哪类HDAC参与诱导MuSC DQ,研究人员利用HDACs抑制剂化学文库进行筛选,发现在能够诱导MuSC DQ的抑制剂中,HDAC1抑制剂高度富集(小编注:研究人员用HDAC1和HDAC2抑制剂处理体外培养的MuSC,发现有2个HDAC2抑制剂可以诱导MuSC DQ,随后研究人员用这2个HDAC2抑制剂(Drox和MC)注射小鼠进行体内验证,发现MuSC并没有表现DQ特征,说明只有HDAC1抑制剂可以诱导MuSC DQ)(Figure S6A–S6D)。为了在体内验证这一结论,研究人员向小鼠腹腔注射了不同的HDACs抑制剂,发现只有HDAC 1抑制剂能够诱导MuSCs DQ(Figure S6E and S6F)。总之,这些结果进一步表明抑制HDAC1可诱导MuSC DQ。

接下来,为了探究在诱导MuSC DQ中起作用的HDAC1的下游调控因子,研究人员检测了BHB处理后MuSC中的蛋白泛乙酰化水平,发现在BHB处理后53kD、17kD、15kD处泛乙酰化修饰水平显著升高(小编注:研究人员检测了MuSC中所有蛋白的泛乙酰化修饰发现53kD、17kD、15kD位置的蛋白泛乙酰化修饰水平升高。由于p53蛋白是HDAC1的经典靶蛋白,且研究人员在先前工作中发现在正常肌肉再生过程中,p53活性被激活。因此研究人员猜测可能p53在BHB处理后乙酰化水平升高,随后用p53乙酰化的抗体进行了验证)(Figure 6A)。由于p53蛋白大小约53kD,是经典的HDAC1靶蛋白,于是研究人员将目光聚焦于p53蛋白。已有研究表明p53可以在不同的位点上发生乙酰化修饰,包括K379,且K379位点乙酰化修饰已被证明可以促进p53的DNA结合活性,诱导癌细胞凋亡并促进某些非癌细胞的存活率,于是研究人员利用p53 K379乙酰化抗体检测发现,禁食、生酮饮食和外源性酮体处理显著提高了MuSC中p53的乙酰化修饰(Figure 6B-6D and S7A),此外通过基因富集分析发现DQ态MuSC中与p53通路相关基因显著富集(Figure 6E),研究人员在先前的研究中也证实了p53活性可提高MuSC存活率(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30244867/)。总之,这些结果表明抑制HDAC1可能通过促进p53乙酰化修饰水平和活性,诱导MuSC DQ。

接下来,为了探究p53在KIDQ中的潜在作用,研究人员构建了p53 KO小鼠(MuSC特异性敲除p53基因的ERT小鼠,即Pax7 CreERT),给小鼠腹腔注射三苯氧胺诱导p53基因特异性敲除,随后饥饿p53 KO小鼠2.5天,发现与WT小鼠相比,p53 KO小鼠MuSC的DQ表型被部分抑制(Figure S7B-S7F)。为了验证p53是否介导BHB对MuSC的直接作用,研究人员分离p53 KO小鼠和WT小鼠MuSC并体外培养,随后用BHB处理体外培养的MuSC 48h,发现敲除p53后,BHB处理不再影响MuSC的细胞存活率和进入S期的速率(Figure 6F and 6G)。这些结果表明p53在酮体诱导MuSC DQ过程中起着重要作用。

为了探究p53活性是否可以诱导MuSC DQ,研究人员给小鼠腹腔注射nutlin-3(p53激活剂),发现nutlin-3激活体内p53活性可再现MuSC的DQ特征(Figure 6H-6J and S7G-S7H),此外,nutlin-3体外处理MuSC 48h也显著提高了MuSC的存活率并抑制MuSC进入S期(Figure S7I and S7J)。研究表明p53活性可以通过其C端赖氨酸乙酰化修饰来调节,例如K379位点(人类K382位点)乙酰化修饰,而将p53蛋白C端多个赖氨酸(K)位点突变为谷氨酰胺(Q)可以模拟高度乙酰化修饰的p53蛋白(p53KQ)。为了证实p53蛋白高度乙酰化修饰是否可以模拟酮体的作用,研究人员构建了p53KQ小鼠,检测p53KQ小鼠MuSC是否表现出DQ特征,发现p53KQ小鼠MuSC中p53活性升高并表现出DQ特征,如细胞体积减小,线粒体数量减少,细胞存活率升高以及抑制MuSC进入S期(Figure 7A-7E)。总之,这些结果表明p53活性可诱导MuSC DQ。

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Fig. 5 酮体以非代谢活性抑制HDAC诱导DQ

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Fig. 6 p53是诱导MuSC DQ的充分必要因素

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Fig. 7 p53蛋白乙酰化可诱导MuSC DQ

Figure S4. 酮体以非代谢途径诱导MuSC DQ

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Figure S5. HDAC药理抑制剂处理可再现酮体和禁食诱导的MuSC DQ表型

Figure S6.  HDAC1抑制剂处理可再现酮体和禁食诱导的MuSC DQ表型

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Figure S7. p53是诱导MuSC DQ的充分必要因素

总结

本篇文章发现了短期禁食、生酮饮食或外源性酮体处理可通过BHB的代谢非依赖性调控功能抑制MuSC中HDAC1活性,诱导p53蛋白乙酰化修饰,促进p53蛋白活性,进而诱导MuSC进入深度静息状态。此时MuSC中肌生成相关基因转录表达下调,肌肉损伤后的修复能力下降,但MuSC应对外界胁迫时的抵抗力增强,存活力显著提高。总之,本项研究揭示了禁食或酮症会激活MuSC中的保护性程序,以提高MuSC面对胁迫时的抗逆性。

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原文链接:
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1550413122001826?via%3Dihub

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