代谢学人

Science Translational Medicine：HIF-1α抑制剂PX-478保护糖尿病中的胰腺β细胞功能

糖尿病是一种以高血糖为特征的代谢性疾病。其中，由胰岛素分泌不足与胰岛素抵抗作用引起的2型糖尿病占总糖尿病比例的90%以上。在糖尿病形成的早期阶段，胰腺β细胞数目增加和功能增强会抵消胰岛素抵抗以维持正常血糖，但持续的代谢超负荷会导致β细胞功能障碍。研究表明，在2型糖尿病发病期，β细胞功能已降低至正常值的50%至80%。不仅如此，由于β细胞功能障碍与胰岛素产生下降直接关联，以往的治疗策略主要集中在增加β细胞的胰岛素分泌，这同时也加重了β细胞的工作量，使其超负荷运行。超负荷运行的β细胞胰岛素分泌调节缓慢，其胰岛素分泌量也无法在胞外葡萄糖含量下降后快速恢复到基础状态，仍保持较高的胰岛素释放。当β细胞长期处于这种状态时，其功能会受到严重损害。目前已有多种药物被证实会对β细胞产生这种有害影响。例如，磺脲类药物已被证实会加速β细胞死亡和功能障碍；胰高血糖素样肽1类似物的长期治疗也被发现可能对β细胞功能带来有害的影响。因此，保护和维持β细胞功能可能是治疗2型糖尿病更有效的方法。

先前研究使用吡莫硝唑加合物（该加合物在缺氧情况下可高度表达）检测细胞内缺氧情况，发现在高剂量葡萄糖环境下，在MIN6细胞轻度缺氧条件检测到哌莫硝唑加合物的形成和缺氧诱导因子1α(HIF-1α)的稳定表达，表明高糖环境下胰岛素分泌具有高氧耗需求，β细胞在体外暴露于高葡萄糖浓度会导致细胞缺氧，并激活缺氧诱导因子-1α(Hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)。HIF-1α在正常环境下被泛素连接酶复合物泛素化并受蛋白酶体降解，由于降解机制中需要分子氧，因此其在低氧环境下能够保持稳定，并与HIF-1β结合形成异二聚体，从而发挥转录因子功能。在激活后，HIF-1α可以激活与血管生成（血管内皮生长因子）、红细胞生成（促红细胞生成素）和葡萄糖转运和糖酵解有关的基因转录从而将能量主要来源由线粒体呼吸转换为糖酵解，促进肿瘤在缺氧条件下的发展。PX-478是HIF-1α抑制剂，在临床中其口服药物处于I期实验阶段。与大多数HIF1α抑制剂不同，PX-478的口服毒性较低，其抑制途径为通过抑制HIF-1α去泛素化，导致多泛素化HIF-1α降解，降低HIF-1α mRNA表达，并影响HIF-1α翻译。PX-478被证实可以通过在体内/外的常氧和缺氧环境中抑制HIF-1α蛋白的表达来发挥抗肿瘤活性。此外，在脂肪代谢方面，PX-478还可以通过抑制HIF-1α的表达从而减轻HFD小鼠体重，改善脂肪组织纤维化和炎症浸润程度。但目前关于HIF-1α和PX-478在2型糖尿病中的具体作用尚不清楚。

近期发表在ScienceTranslational Medicine上的一篇题目为“HIF-1α inhibitor PX-478 preserves pancreatic β cell function indiabetes”便从该问题出发，发现β细胞在压力状态下产生的HIF-1α会抑制β细胞活性，从而引起胰岛素抵抗，当使用HIF-1α抑制剂PX-478后，可以显著改善β细胞功能和活性，但不增加胰岛素分泌量，通过阻止β细胞超负荷运行，使其在高糖环境转变为基础低糖环境后快速恢复对基础胰岛素分泌的下调，从而降低小鼠的血糖水平，起到更好的2型糖尿病治疗效果。

先前研究表明，db/db小鼠的胰岛对吡莫硝唑加合物（该染色可用来检测组织缺氧）呈阳性，说明db/db小鼠的胰岛呈缺氧状态。为探究缺氧是否介导糖尿病小鼠β细胞中HIF-1α的稳定性，作者使用HIF-1α抗体进行免疫细胞化学检测。与瘦小鼠胰岛相比，在ob/ob小鼠、高脂饮食(HFD)小鼠和db/db小鼠的胰岛内β细胞核区室中可检测到HIF-1α蛋白（图1A）。此外，db/db小鼠的胰岛中HIF-1α几种靶基因蛋白丰度显著增加（如葡萄糖转运蛋白1(Glucose transporter-1, GLUT1)、丙酮酸脱氢酶激酶1(Pyruvate dehydrogenase kinase 1, PDK1)和乳酸脱氢酶1(Lactate dehydrogenase A, LDHA)（图1B-C），这证实糖尿病小鼠胰岛的HIF-1α被激活。

图1. 在糖尿病小鼠模型β细胞中检测到转录因子HIF-1α

接下来，作者研究了在糖尿病或糖尿病前期小鼠中，葡萄糖剂量引起代谢负荷的急剧增加是否会增加胰岛中吡莫硝唑加合物的形成（将吡莫硝唑作为缺氧标志物）。与非肥胖对照（图2A-C）或NCD喂养小鼠（图2D-F）相比，ob/ob或糖尿病前期（60kcal% HFD喂养1年）小鼠胰岛由葡萄糖负荷引起的缺氧程度显著上升。这些结果表明，在高糖耐量小鼠中（图2C-F），代谢负荷的急剧增加使细胞呈现缺氧状态。

图2. 葡萄糖负荷导致糖尿病模型小鼠的胰岛中吡莫唑加合物合成增加

为了探究高葡萄糖代谢是否导致细胞缺氧，作者将分离的C57BL/6J小鼠胰岛进行体外培养，并使用22mM的葡萄糖，或葡萄糖激酶GCK激活剂GKA50（小编注：当胰岛细胞感受到高浓度葡萄糖后，会通过激活GCK启动胰岛素分泌。因此作者这里直接使用GKA50激活GCK从而增加胰岛细胞负担）处理，或两者同时处理（图2G；图S1A），均会导致吡莫硝唑加合物增加，表明细胞缺氧。由于吡莫硝唑加合物的形成是发生在低氧张力下，同时还需要还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸/还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADH/NADPH)的参与。为了排除吡莫硝唑加合物生成的增加是由于NADH随葡萄糖浓度增加而急剧升高引起的，作者比较了在22mM葡萄糖下培养2h和8h的胰岛（NADH浓度不再升高）（小编注：作者在这里并没有给出2h和8h进行检测的文献来源，也没有对其进行相关的解释，推测作者可能是想要排除在氧气未被大量消耗状态下给予高糖后NADH因TCA循环而大量产生所造成的影响），且仅在培养的最后2小时添加吡莫硝唑。结果显示，8h时吡莫硝唑加合物含量高于2h时（图2H和图S1B），这表明加合物形成的增加是由细胞缺氧所致。为了探究高葡萄糖代谢中参与胰岛素分泌的其他因素是否促进细胞缺氧，作者在钙通道抑制剂硝苯地平或钾离子通道激活剂二氮嗪存在下，同时使用GCK激活剂GKA50处理胰岛，发现二氮嗪可以诱导三磷酸腺苷浓度升高和随后抑制磷酸果糖激酶-1后糖酵解降低，从而减少吡莫硝唑加合物的合成，而硝苯地平则无明显影响(图2I和图S1C)。这些结果表明，在响应高糖代谢而引起细胞缺氧过程中，细胞内钙离子浓度([Ca²⁺]_i)的增加并不是必需的。反而K⁺通道的激活能够逆转细胞的高度缺氧。通过分析高浓度葡萄糖下胞内钙离子的变化，也证实了硝苯地平或二氮嗪处理对细胞功能的预期影响(图S2)。与预期结果一致，这两个化合物都对葡萄糖刺激的[Ca²⁺]_i有显著影响，而只有硝苯地平影响KCl诱导的[Ca²⁺]_i（小编注：在生理条件下，葡萄糖浓度增加时，β细胞会关闭ATP敏感的钾离子通道，使得膜发生去极化至打开钙离子通道的阈值电位。当通道打开时，钙离子流入从而促进胰岛素分泌。因此，作者通过对钾离子和钙离子通道进行检测，从而检测这两种影响因素的参与程度）。

图S1. C57BL/6J小鼠胰岛糖代谢增高导致细胞缺氧

图S2. 硝苯地平和二氮嗪对C57BL/6J小鼠胰岛细胞内Ca²⁺处理的影响

NADH与吡莫硝唑加合物

在肿瘤研究中，缺氧微环境已经成为治疗肿瘤的研究方向之一。缺氧微环境的识别主要是利用缺氧标记物来进行表征。目前已知的缺氧标记物主要包括CCI-103F、EF5和SCUBE1等。其中广泛使用的是2-硝基咪唑缺氧标记物-吡莫硝唑，该标记物可有效地用于人体和动物中各种组织的缺氧标记。在常氧环境下，氧气可以氧化吡莫硝唑形成N-氧化物从而抑制其活性。而在缺氧环境下，吡莫硝唑从NADPH/NADH中获取电子，还原活化并共价结合至缺氧细胞含巯基的蛋白质，从而形成加合物。

鉴于吡莫硝唑对NADH的依赖性，在本文中，作者需要排除吡莫硝唑是否单纯因为NADH的急性增加而非缺氧环境引起上调表达。因此，作者对比了刚进入高糖环境和在高糖环境下培养6h的胰岛，并继续加入吡莫硝唑培养2h以进行充分反应，从而探究NADH的剧烈变化对吡莫硝唑和缺氧环境的影响。

参考文献：

[1] Arteel GE et al. Eur J Biochem. 1998 May 1;253(3):743-50.

[2] Matschinsky FM et al. J Biol Chem. 1986 Oct25;261(30):14057-61.

图3. 高糖代谢下PX-478可恢复基础胰岛素分泌，防止低糖时[Ca²⁺]_i振荡。

为了探究HIF-1α抑制剂PX-478对小鼠胰岛功能的影响，作者检测了在有无抑制剂存在下，使用GCK激活剂处理C57BL/6J小鼠胰岛20h后对胰岛素释放的影响。GCK激活导致基础胰岛素分泌的剂量依赖性增加，但不影响高葡萄糖浓度下的胰岛素释放（图3J）。HIF-1α抑制剂使基础胰岛素分泌显著降低至接近对照组，且刺激指数随之增加（图3K），而胰岛素含量保持不变（图3L）。这些结果表明，用PX-478处理代谢超负荷的小鼠胰岛可通过恢复葡萄糖依赖性胰岛素分泌来改善β细胞功能。

由于[Ca²⁺]_i是连接葡萄糖感知/代谢与胰岛素释放的主要触发信号，作者接下来探究了高葡萄糖代谢如何影响β细胞内Ca²⁺的变化。在记录[Ca²⁺]_i之前，作者使用GKA50处理胰岛20h并在含有3mM葡萄糖的灌注缓冲液中禁食2h（图3M-Q）。经历高代谢活动的胰岛在基础低葡萄糖浓度下显示出[Ca²⁺]_i振荡，并且使用HIF-1α抑制剂PX-478处理可以防止这些基础[Ca²⁺]_i振荡（图3R和图S5）（小编注：葡萄糖刺激引起的[Ca²⁺]_i振荡会引起胰岛β细胞响应，加重胰岛β细胞负荷，因此对其进行抑制可以减轻β细胞的负荷，降低先前高代谢胰岛细胞的胰岛素释放）。GCK的激活还会导致胰岛对葡萄糖的反应加快，且PX-478没有改变这种反应（图3S）。考虑到胰岛在记录到[Ca²⁺]_i变化前2h禁食，可以得出结论，即基础[Ca²⁺]_i振荡的存在是由胰岛表型变化引起的。尽管GCK激活剂与PX-478共处理降低了[Ca²⁺]_i对葡萄糖的反应（图3T），但这对高葡萄糖浓度下的胰岛素分泌没有任何有害影响（小编注：说明PX-478主要作用是通过降低[Ca²⁺]_i对葡萄糖的反应从而减轻在高葡萄糖浓度转变为低葡萄糖浓度后β细胞仍存在的持续负荷，恢复基础胰岛素分泌，但是其在高葡萄浓度情况下不会显著影响胰岛素分泌）。

图S5. Ca²⁺含量检测

db/db小鼠是肥胖2型糖尿病的极端模型，其特征是β细胞功能早期丧失。db/db小鼠在早期出现高胰岛素血症，随后出现β细胞衰竭，导致2-3个月大时出现持续性高血糖症。此外，从这些动物新鲜分离的胰岛具有较高的基础胰岛素分泌和低葡萄糖下的[Ca²⁺]_i振荡。因此，作者利用6周龄的db/db小鼠，每周两次腹腔注射PX-478(30mg/kg)或PBS，以探究PX-478对db/db小鼠糖尿病进展的影响(图4A)。结果显示，两组小鼠体重均出现上升，且无显著差异（图4B）。在对照组中，非空腹血糖从5周龄开始上升，直到9周龄后保持较高水平（图4C）。使用PX-478处理的 db/db小鼠则没有观察到这一现象。此外，5周龄的db/db小鼠出现高胰岛素血症，血浆胰岛素值比db/+对照小鼠高10-15倍（图4D）。其中，对照组小鼠血浆胰岛素浓度以年龄依赖性方式下降，而使用PX-478处理的小鼠的胰岛素浓度持续升高。这些结果表明PX-478处理的小鼠胰腺β细胞保持了分泌大量胰岛素的能力。

为了进一步表征这些动物的代谢状态，作者又进行了葡萄糖和胰岛素耐受性实验。使用PX-478处理的db/db小鼠表现出更好的葡萄糖耐受性和更高的血浆胰岛素浓度（图4E-G），以及β细胞功能（HOMA-β）的稳态模型评估（HOMA）值的改善(图4H)。胰岛素耐受试验曲线下面积和胰岛素抵抗HOMA（HOMA-IR）显示（图4I-J），在处理组小鼠中未观察到外周胰岛素敏感性的改善。在葡萄糖和胰岛素耐受性实验中，PX-478处理组小鼠的空腹血糖值接近db/+对照组，而其血浆胰岛素则是未处理db/db小鼠的两倍。考虑到PX-478处理的小鼠没有表现出胰岛素敏感性的改善，因此可以推测血浆胰岛素浓度升高和β细胞功能改善提高了PX-478处理组小鼠的葡萄糖耐受性。

为了评估PX-478处理对小鼠外周组织的影响，作者分析了db/db小鼠内脏和皮下白色脂肪组织(WAT)中与脂肪细胞功能和胰岛素敏感性相关基因的表达。令人惊讶的是，使用PX-478处理后，只有内脏WAT中Ucp1和Fasn表达恢复到瘦小鼠的水平（图S6），在皮下WAT中则未观察到基因表达的变化（图S7），这表明PX-478处理不会改善胰岛素介导的脂肪生成途径。此外，与对照组相比，处理组内脏WAT中Acc1表达未恢复，Dgat1的mRNA表达下调。在使用PX-478处理的db/db小鼠的肝脏中也未观察到对脂质代谢的明显影响。与之相反的是，Gck的上调和Pdk4和G6Pase表达的下调表明PX-478对肝脏葡萄糖代谢具有潜在的有益影响（图S8）。

为了评估用PX-478处理肥胖驱动的胰岛素抵抗小鼠模型是否会对β细胞功能产生有害影响（小编注：这里是为了评估这种药物会不会像其他治疗2型糖尿病的药物一样，刺激胰岛素释放，实际上对β细胞造成了损伤，在长期损伤后反而可能使得病情恶化，这也是本研究的主要创新点），作者使用两种不同剂量的HIF-1α抑制剂（PX-478）处理HFD喂养4周的小鼠（图S9A)。较低剂量的PX-478（30 mg/kg）处理可阻止HFD引起的体重增加，而用45 mg/kg处理的小鼠体重明显下降（图S9B-C)。与NCD小鼠相比，HFD小鼠的非空腹血糖没有显著差异（图S9D），但HFD-PBS组非空腹血浆胰岛素浓度增加，而HFD-PX-478组小鼠胰岛素水平降低（图S9E）。与HFD-PBS组小鼠相比，HFD-PX-478组小鼠的葡萄糖耐受性略有改善（图S9F-G），并且这种改善伴随着较低的空腹血浆胰岛素水平（图S9H）。PX-478(45 mg/kg)处理改善了胰岛素耐受性并降低了HOMA-IR（图S9I-K）。因此，可以判断HIF-1α抑制剂可提高HFD小鼠的胰岛素敏感性。虽然PX-478在HFD小鼠中介导的葡萄糖耐量改善与较低的空腹胰岛素值和更高的胰岛素敏感性有关，而在db/db小鼠中，该抑制剂处理引起了更高的空腹胰岛素水平但没有改善胰岛素抵抗。

图4. HIF-1α抑制剂PX-478处理db/db小鼠可抑制糖尿病进展

图S6. PX-478对db/db小鼠内脏WAT基因表达无显著影响

图S7. PX-478对db/db小鼠皮下WAT基因表达的影响

图S8. PX-478治疗对肝脏糖代谢相关基因表达有正调节影响

图S9. PX-478处理HFD小鼠可导致体重下降和胰岛素敏感性改善

2型糖尿病使β细胞处于持续的代谢压力之下。本研究表明，小鼠胰岛的高代谢负荷可以引起缺氧表型，促进HIF-1α积累、损害β细胞功能，从而引起胰岛素分泌失调。而HIF-1α抑制剂PX-478改善了db/db和链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠模型中的β细胞功能。此外，PX-478也改善了在高葡萄糖条件下培养的人胰岛类器官的正常胰岛素分泌，并增加了葡萄糖诱导的人胰岛类器官中胰岛素分泌的刺激指数，表明可尝试用于临床研究。

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