编辑 | 孟美瑶

校对 | 陈俊桐

时间在流逝，学习的脚步不能停

随着一年年一岁岁的长大

我们变得成熟，也会面临衰老

“衰老”，即机体器官功能的衰退，代谢的受损

对抗衰老一直是医学界永恒的话题

你可否知道

不良的习惯也会加剧我们身体器官的衰老呢？

本文我们就一起来看看

胰岛素抵抗和胰岛β细胞衰老之间的关系吧！

糖尿病（DM）是一类糖脂代谢紊乱的慢性代谢性疾病。据国际糖尿病联合会报告，截至2021年12月，全球约5.37亿20-79岁的成年人患有糖尿病，即在全球20-79岁人群中，糖尿病患病率约为10.5%。这些糖尿病患者中有90%为2型糖尿病（T2DM），其主要诱因一般是不健康的生活方式、精神压力大、肥胖和遗传等因素。T2DM的主要特征是胰岛素抵抗和胰腺β细胞功能受损，并伴有β细胞质量减少和细胞特征标记物丢失等情况。 

以往有证据表明，外周组织的胰岛素抵抗会迫使β细胞分泌更多胰岛素，使β细胞逐渐衰竭和功能受损，最终引发T2DM。而临床环境中常用的抗糖尿病药物，如磺酰脲类药物仍会迫使受损的β细胞分泌胰岛素，致使β细胞进一步受损，不能充分保护β细胞，最终无法从根源上阻止T2DM的发展。因此将研究方向转向于如何减轻胰岛素抵抗和探究β细胞功能受损的机制更有助于T2DM的治疗。

微粒体本质上为细胞破碎后由内质网碎片自我融合而形成的小型囊泡结构。微粒体包含内质网膜和核糖体两种基本成分。在体外实验中，微粒体具有蛋白质合成、蛋白质糖基化和脂类合成等内质网的基本功能。微粒体前列腺素E合酶-1（mPGES-1）、胞质PGES（cPGES）和微粒体前列腺素E合成酶-2（mPGES-2）是三种已知的前列腺素E2（PGE2）合成酶。前列腺素是前列烷酸的衍生物,其中PGE2是花生四烯酸(AA)的衍生物。PGE2与多种生理过程有关，它能够诱导血管扩张或收缩，从而在肾脏血流动力学调节、血压控制、分娩和胃肠运动等过程中尤其重要。同时PGE2也在调节体温、睡眠-觉醒机制、胃肠道分泌以及黏膜屏障功能中也起着至关重要的作用。此外，PGE2还参与免疫调节，在炎症反应中能够抑制T细胞激活；也可在特定情况下影响辅助性T细胞的增殖和分化。PGE2有多条合成途径，一是通过微粒体前列腺素E合酶-1（mPGES-1）催化环氧化酶-1（cyclooxygenase-1，COX-1）和COX-2衍生的前列腺素H2（PGH2），来生成PGE2，该催化过程在炎症反应、动脉粥样硬化及癌症等的病理中发挥重要作用。二是通过Ptges3基因编码的cPGES，可将前列腺素内过氧化物H2（PGH2）转换为PGE2；三可通过Ptges2基因编码的mPGES-2来生成PGE2。mPGES-2是双功能酶，可以与谷胱甘肽（GSH）和血红素形成复合物，催化前列腺素H2（PGH2）转化为（12S）-羟基-（5Z，8E，10E）-羟基七碳三烯酸（HHT）（注：也称为前列腺烷三烯酸，HHT）和丙二醛（MDA）。在本研究中作者通过测定这三类基因的表达水平排除了PGE2其他合成途径的影响，从而证明了由mPGES-2催化生成的PGE2在糖代谢中特异性作用。一些临床报告表明，在三个独立的白人群体中PTGES2 R298H的多态性与胰岛素抵抗和T2DM相关。因此，研究mPGES-2对β细胞功能和糖代谢的影响机制有助于开发针对β细胞保护的新型抗糖尿病药物。

有研究表明，细胞衰老可能是导致β细胞功能受损的原因。在本研究中，作者通过mPGES-2敲除小鼠研究mPGES-2对β细胞的影响时发现，mPGES-2缺失在胰岛素分泌和糖代谢过程中可以抑制β细胞衰老，这有助于通过研究mPGES-2的下游信号通路发现细胞衰老是如何引发β细胞功能受损的。最终作者通过RNA测序（RNA-seq）和病理学分析的技术手段发现，mPGES-2缺乏通过作用于PGE2–EP3–NR4A1信号通路抑制胰岛β细胞衰老并保护β细胞。作者又通过进一步地筛选，发现mPGES-2抑制剂SZ0232可以保护β细胞，增强胰岛素分泌，改善糖尿病。本篇阐述结果表明mPGES-2抑制剂可通过改善β细胞的功能来作为治疗糖尿病的新靶点。

为了研究mPGES-2在糖代谢中的作用，作者构建了mPGES-2野生型（WT；Ptges2+/+）和mPGES-2全身敲除型（KO；Ptges2−/−）小鼠（附图1a，b）。在常规饮食中，WT和mPGES-2 KO小鼠之间的体重没有差异（附图1c）。为了确定mPGES-2在葡萄糖稳态中的作用，作者分别对8周、16周、32周和52周的 WT和mPGES-2 KO小鼠进行了葡萄糖耐量试验（图1a）。结果显示，从第16周开始，mPGES-2的缺失使小鼠的葡萄糖的耐受能力变好，并且随着年龄增长，WT和KO小鼠之间的差距更大。同时，mPGES-2缺失也会促进小鼠胰岛素的分泌（图1b），与WT小鼠相比，mPGES-2 KO小鼠的胰岛有更高的葡萄糖刺激胰岛素分泌（GSIS）水平（图1c）。这种GSIS的增强可能是mPGES-2 KO小鼠糖耐量改善的原因。此外，研究者还观察到mPGES-2的表达定位在胰岛中，并且表达量随着年龄的增长而增加（图1d、e和附图1d-f），这说明在衰老的状态下，mPGES-2缺失可以在一定程度上改善葡萄糖耐量。

高脂饮食（HFD）动物模型被广泛应用于代谢性疾病（包括肥胖、脂肪肝和T2DM等疾病）的研究。一般来说，HFD会导致小鼠出现体重增加、高血糖、高胰岛素血症、胰岛素抵抗、炎性细胞因子分泌和异位脂质积聚等现象。研究者用HFD处理WT和mPGES-2 KO小鼠，发现这两种小鼠体重无差异（附图1g）。然而，随着年龄的增长，HFD处理的mPGES-2 KO小鼠也显示出葡萄糖耐受性改善的情况（图1f）。说明mPGES-2以年龄相关的方式参与了葡萄糖代谢。mPGES-1是另外一种比较重要的PGE2合成酶，为了证实mPGES-2在调节胰岛素释放和糖代谢中的特异性，研究者又在mPGES-1缺陷小鼠中进行了一系列实验，发现WT（Ptges+/+）和mPGES-1 KO（Ptges−/−）小鼠在体重、糖耐量、胰岛素释放或胰岛中PGE2生成等方面均没有显著差异（图1g、h和附图2a-h），说明随着年龄的增长，mPGES-2能够特异性地影响胰岛的功能，影响小鼠的糖代谢。

图1.mPGES-2缺失可改善与衰老相关的β细胞功能

为了研究mPGES-2缺陷小鼠的葡萄糖代谢改善和胰岛素分泌增加的机制，研究者从正常饲料（NCD）饲喂的WT和mPGES-2 KO小鼠中分离出胰岛，进行RNA-seq分析，发现关键的β细胞特征标记基因，即Mafa、Nkx6-1和Pdx1在mPGES-2缺陷小鼠中表达量显著增加（图2a，附图3a）。免疫荧光实验进一步表明，关键的β细胞标记物（如Pdx1、MafA和Glut2），在mPGES-2 KO小鼠的胰岛中表达增加（图2b,c和附图3b,c）。有研究报道，关键的β细胞标记物基因在衰老细胞中会明显下调， 研究者便对胰岛β细胞中衰老标记物的表达进行了分析，结果发现：HFD条件下，与WT组相比，在16周到1.5年的mPGES-2 KO小鼠的胰岛中p16、IGF1R表达和β-半乳糖苷酶（β-Gal）染色程度明显下调（图2d，e），表明mPGES-2缺失可以抑制β细胞的衰老，并维持了胰岛的形态。

HFD条件下的小鼠通常表现出略微的β细胞功能障碍。为了研究mPGES-2在更严重的β细胞功能障碍中的作用，研究者将Ptges2-/-小鼠与db/m小鼠进行杂交，得到了db/db Ptges2-/-和db/db Ptges2+/+小鼠。在db/db小鼠中，β细胞往往会经历快速且严重的衰老过程，最终导致细胞损伤。与先前数据相一致，腹腔葡萄糖耐量试验（IPGTT）结果显示，db/db Ptges2-/-小鼠的葡萄糖耐量明显比db/db Ptges2+/+小鼠更好，而这两种小鼠的体重和胰岛形态没有明显差异（图3a，b和附图3d，e）。研究者还观察到相比于db/m小鼠而言，db/db小鼠的胰岛中mPGES-2表达量增加（图3c）。db/db Ptges2-/-小鼠的关键β细胞标记物基因的表达水平也明显高于db/db Ptges2+/+小鼠（图3d,e和附图3f）。同时，在HFD条件下，作者发现db/db Ptges2-/-小鼠的衰老标志物p16、IGF1R和β-Gal的表达水平也明显低于db/db Ptges2+/+小鼠组（图3f-h）。这些数据表明，在糖尿病状态下，mPGES-2缺失对β细胞有保护作用，这一保护作用可能是通过减轻β细胞的衰老和改善β细胞的特性实现的。

图3  mPGES-2缺失可保护db/db小鼠的β细胞

附图3

为了进一步分析mPGES-2对β细胞功能和葡萄糖代谢的具体影响，作者通过AAV8-小鼠胰岛素1启动子（MIP）- mPges-2绿色荧光蛋白（GFP）胰腺导管灌注构建了β细胞特异性的mPges-2过表达小鼠模型，并通过免疫荧光证实了AAV-MIP - mPGES-2-GFP在胰岛中的有效传递（图4a）；Western blotting实验也证实了mPGES-2在胰岛中的过表达（图4b）。结果表明，在NCD条件下的β细胞过表达mPGES-2小鼠，表现出糖耐量受损和胰岛素分泌减少的状态（图4c,4d）；此外，β细胞特异性的mPGES-2过表达降低了β细胞特性基因的表达水平，同时增加了衰老标志物的表达水平（图4e-g）。结果表明，mPGES-2在调节糖代谢和β细胞衰老中起着重要作用。

图4 β细胞特异性的mPGES-2过表达可加剧β细胞衰老

研究者通过对Ptges2flox/flox小鼠（附图1a，b）进行胰腺导管内AAV8–MIP–cre–GFP输注获得的β细胞特异性mPGES-2 KO（β-KO）小鼠，来证实mPGES-2对β细胞功能和糖代谢的特异性作用。首先，作者通过免疫荧光法评估AAV8–MIP–cre–GFP的输注效果，然后使用western blot分析（蛋白免疫印迹法）最终证实了β细胞mPGES-2的特异性敲除（附图4a，b）。结果表明，β细胞特异性mPGES-2 KO小鼠表现出糖耐量改善和衰老标记物表达量的减少的特征；HFD条件下的小鼠也表现出了更高的GSI水平和β-细胞特征标记基因的表达水平（附图4c-g）。这些结果有力地证明了mPGES-2可以通过调节β细胞衰老在糖代谢和改善β细胞功能中发挥关键作用。

附图4 

以往研究表明，mPGES-1在体外培养过程中并不介导PGE2的生成及胰岛的病理变化，但是mPGES-2是否有助于胰岛内PGE2的生成尚不清楚。研究表明，mPGES-2可以与GSH-血红素复合物结合，催化PGH2形成HHT和MDA，但在体内实验的许多组织中mPGES-2并不能催化PGE2的形成。本研究中作者检测了PGE2在不同组织中的生成情况，发现mPGES-2缺乏并不影响肝脏、肾脏或棕色脂肪中PGE2的生成，但从Ptges2−/−小鼠中分离的胰岛中的PGE2水平来看，mPGES-2缺乏减少了PGE2在胰岛中的生成（图5a和附图5a）。通过qRT–PCR分析发现，mPGES-2缺乏并未影响胰岛中Ptges和Ptges3的mRNA水平（附图5b）。同时，作者在第8周和第32周时检测了小鼠胰岛中Ptges、Ptges2和Ptges3的表达水平，发现只有mPGES-2会随着年龄的增加而表达量增加（附图1d）。这些结果表明，PGE2生成减少可能是由mPGES-2缺失引起的。由于mPGES-2对血红素有很强的亲和力，随后研究者对不同组织中的血红素水平进行了测定，发现胰腺中的血红素水平远低于其他组织（图5b）。接着，作者又从WT小鼠中分离出胰岛，并将其与100 nM血红素孵育10 h，结果发现，在血红素的作用下，胰岛的PGE2水平降低（图5c）。此外，研究者还测定了WT和mPGES-1 KO小鼠胰岛分泌的PGE2水平，未观察到任何差异（附图2h）。这些结果表明，胰腺中低水平的血红素会导致胰腺中存在着高水平的无血红素的mPGES-2，进而诱导胰岛产生PGE2。

研究者还测定了8周龄和16周龄小鼠体内PGE2的产生情况。结果发现，16周龄小鼠胰岛中的PGE2水平远高于8周龄小鼠（图5d），这表明16周龄小鼠胰岛中存在更高水平的mPGES-2。基于这些数据，研究者在体外构建了mPGES-2过表达的INS-1细胞（附图5c）。当mPGES-2在这些细胞中过度表达时，PGE2的生成量增加，而cAMP和胰岛素分泌水平下降（图5e-g），并且这一系列影响可被EP3受体拮抗剂L-798106所逆转（图5f，g）。这表明mPGES-2通过提高PGE2的水平来抑制胰岛素释放，PGE2水平提高又反过来激活EP3受体，进而抑制cAMP信号通路。研究者又在老年小鼠中观察到更高的mPGES-2表达水平（图1d、e和附图1d），这在一定程度上解释了两种基因型小鼠在第8周并未出现但在第16周时却发现了糖耐量差异的现象。这些数据表明，mPGES-2在不同年龄段的表达水平不同，导致了依赖于PGE2生成的胰岛功能的变化。

为了探索mPGES-2促进β细胞衰老的机制，研究者分析了Ptges2敲除前后胰岛RNA-seq的结果，发现在Ptges2−/−小鼠中Nr4a1的水平显著上调（图5h）。这一发现通过qRT–PCR和免疫荧光染色分析得到进一步验证（图5i–k）。研究者进一步检测了NR4A1在INS-1细胞中的表达，发现当mPGES-2过表达时，NR4A1的表达受到了抑制（图5l）。 

有研究表明，NR4A1可以与细胞核中的肝激酶B1（LKB1）结合，并将LKB1隔离在细胞核内，并且胰岛β细胞中缺失LKB1可以促进胰岛素分泌和增加β细胞数量。作者发现，在mPGES-2过表达的INS-1细胞中，LKB1的表达随着β细胞特征性基因的表达量的降低而增加（图5L）。此外，由mPGES-2过表达导致的NR4A1和p21的变化会被EP3受体拮抗剂L-798106逆转（图5m）。有研究报道，NR4A1在肌肉、脑垂体和肝脏等组织中的表达与cAMP信号通路相关，但目前尚不清楚胰腺中是否也存在这种联系。所以研究者使用cAMP类似物8-Br-cAMP处理INS-1细胞，发现经8-Br-cAMP处理后，NR4A1表达水平升高（附图5d）。

为了进一步确定NR4A1通路是否参与了促进β细胞衰老的过程，研究者又在INS-1细胞中诱导NR4A1表达，然后发现当NR4A1过表达后，p21表达被显著抑制（附图5e）。紧接着，作者又使用NR4A1的转录激活剂cytosporone B（Csn-B）来处理mPGES-2过表达INS-1细胞，发现衰老标记物的水平显著降低，而β细胞特征标记基因的水平增加（图5n）。这些结果在NR4A1和mPGES-2双重过表达的INS-1细胞中也得到了证实（附图5f）。此外，研究者还对mPGES-2过表达是否会影响β细胞增殖进行了检测，结果在体内和体外均未观察到明显差异（附图2a-c）。同时，研究者敲除了INS-1细胞中的mPGES-2基因，发现NR4A1信号通路增强，衰老标记物减少，胰岛素分泌量增加（附图5g，h）。这些结果表明，mPGES-2可能诱导胰岛中PGE2的合成，增强EP3对cAMP–NR4A1信号通路的拮抗作用，从而促进β细胞衰老。

图5 mPGES-2通过EP3/NR4A1信号轴促进β细胞衰老

附图5

        在验证了mPGES-2在调节β细胞功能和糖代谢中的作用后，研究者试图通过高通量筛选来鉴定mPGES-2抑制剂。经过两轮的高通量虚拟筛选，从中选出63个化合物。在这些化合物中，作者发现N，Nʹ-（（4-（（2-氧吡咯烷-1-基）苯基）磺酰胺基）-1,2-亚苯基）双（氧基）双（乙烷-2,1-二酰基））二乙酰胺（以下简称SZ0232）对mPGES-2表现出最佳的抑制活性（图6a，b）。通过基于分子对接的虚拟筛选分析了mPGES-2–SZ0232复合物的对接构象，阐明了SZ0232的结合模式：即SZ0232通过主链残基中Val148和Ser165的两个氢键以及侧链残基Arg137、Arg146、Lys147和Lys200中的四个氢键与mPGES-2酶的活性位点实现完全对接；同时，SZ0232与mPGES-2中的Phe112还会形成有力的 π-π 堆积相互作用（图6c）。经过细胞毒性分析发现，SZ0232在0.01μM至100μM浓度范围内对MIN6细胞不会产生显著毒性（附图6a）。同时，SZ0232不影响参与PGE2合成的两种酶mPGES-1和COX-2的活性（附图6b，c）。因此，SZ0232可作为对细胞无毒性的，最佳的mPGES-2抑制剂进行后续的研究。

        为了研究SZ0232对胰岛功能的影响，研究者用不同浓度的SZ0232处理16周龄小鼠的胰岛。与未经处理的胰岛相比，浓度为10μM的SZ0232会显著增加GSIS，降低PGE2水平（图6d，e）。同时，SZ0232也可刺激胰岛素分泌（与GLP-1受体exendin-4的作用效果相似）（图6f），但SZ0232并不会改变胰岛的基础胰岛素分泌量（这一点与格列本脲不同）（图6g）。这表明SZ0232可以起到促进胰岛素分泌的效果，并且不会像格列本脲治疗那样出现危及生命的低血糖症状。

        这些数据有力地支持了mPGES-2通过PGE2–EP3信号通路影响胰岛素分泌的假设。研究者进一步研究了在SZ0232治疗中PGE2受体EP3分别在使用EP3拮抗剂L-798106和激动剂前列磺酮后促进胰岛素生成过程中的作用。研究发现，与SZ0232不同的是，前列磺酮处理后可阻断SZ0232促进胰岛素分泌的作用，而L-798106处理对SZ0232诱导的GSIS变化无明显影响（图6h）。然后，研究者又在从不同年龄动物分离的胰岛中检测SZ0232对GSIS水平的影响，发现SZ0232促进胰岛素分泌的作用会随年龄增长而增强（附图6d）。此外，研究者还比较了SZ0232对mPGES-2 KO小鼠和WT小鼠胰岛中胰岛素生成的影响，发现在低葡萄糖和高糖条件下SZ0232均不会提高mPGES-2 KO小鼠胰岛中的GSIS水平（附图6e，f）。在mPGES-2 KO小鼠和WT小鼠获得的胰岛中也观察到SZ0232在胰岛素生成方面类似的作用（附图6g）。这些数据进一步证明，SZ0232通过靶向mPGES-2抑制了PGE2–EP3途径从而促进胰岛素分泌。此外，SZ0232还会显著抑制因mPGES-2过表达诱导的β细胞衰老作用，这也进一步证实了mPGES-2在调节β细胞衰老中的重要作用（附图6h）。 

        紧接着，作者将SZ0232处理db/db小鼠，来分析其是否适合作为治疗糖尿病的药物。通过持续8周每天给db/db小鼠注射0.5mg kg-1的SZ0232，作者并未观察到体重、肝脏和肾脏功能血清学指标的差异（附图7a，b）。经SZ0232处理WT小鼠（补充图3a、b）和db/db小鼠（附图7c），在不同组织的组织形态学和血清生化参数方面没有观察到明显的毒性。值得注意的是，在注射SZ0232药物8周后，db/db小鼠的葡萄糖耐受性比对照组的db/db小鼠更好（图6i）。此外，SZ0232处理的db/db小鼠的β细胞特征标记基因水平也显著地增加（图6j-l），衰老标记物表达量显著减少。这些结果证明，mPGES-2抑制剂SZ0232在体内可以通过保护β细胞功能、抑制β细胞衰老来改善T2DM。

图6 mPGES-2抑制剂的筛选和评价

附图6

附图7

为了研究人类胰岛中mPGES-2的表达是否与年龄有关，研究者检测了人类胰岛中mPGES-2的表达水平。结果表明，mPGES-2的表达水平随着年龄的增长而增加，与年龄呈正相关关系（图7a，b），这与研究者在小鼠中发现的结果相一致。作者还发现mPGES-2的表达定位于人类胰岛（附图1f）。这些结果表明，mPGES-2的表达可能参与了与年龄相关的人类β细胞衰老的过程。

图7 人类胰岛中mPGES-2与衰老的关系

     在本篇研究中，作者发现mPGES-2通过PGE2–EP3–NR4A1信号轴促进了β细胞的衰老从而引发胰岛相关的功能障碍。首先，为了阐释mPGES-2在糖代谢中促进β细胞的衰老的机制，作者通过RNA-seq、qRT-PCR和免疫荧光等方法对不同饮食、不同周龄的两种基因型mPGES-2 WT/KO小鼠中检测胰岛素分泌水平以及糖耐量等其他生理指标，发现mPGES-2缺失通过增加β细胞中特征标记基因的表达来改善β细胞的衰老并维持其特性。 

其次，作者又在糖尿病小鼠和β细胞特异性缺乏或过表达mPGES-2小鼠中进行了相关实验，发现在病理状态下mPGES-2缺失也可通过上述机制保护受损的β细胞。此外，作者分析了mPGES-2缺失是如何促进胰岛素分泌的，发现mPGES-2可以随年龄增长调节PGE2在胰岛中的生成进而影响胰岛的功能。文章最后，作者又通过相关受体的拮抗剂、转录激活剂发现了mPGES-2通过PGE2–EP3–NR4A1信号轴促进了β细胞的衰老过程。 

因此，SZ0232（mPGES-2的抑制剂）可以在体内通过保护β细胞来改善T2DM，并因其较低的细胞毒性有望投入临床使用。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s42255-022-00536-6

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